1: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ một α-helix 2: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ nhiều α-helix 3: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ cấu trúc beta barrel 4: Protein xuyên một phần vào màng
5: Protein neo với màng qua một cầu lipid
6: Protein neo với màng qua một nhóm oligosaccharide gắn với một cầu lipid 7, 8: Protein gắn gián tiếp với màng thông qua một protein xuyên màng khác
Các vùng lộ ra môi trƣờng ngoại bào của các protein màng thƣờng liên quan tới các tƣơng tác tế bào – tế bào và gắn với những phân tử tín hiệu, trong khi đó những vùng định vị bên trong tế bào chất có vai trị quan trọng trong việc liên kết với bộ khung xƣơng tế bào và kích hoạt các con đƣờng tín hiệu nội bào. Việc điều hịa các protein màng thƣờng đạt đƣợc bằng cách phosphoryl hóa các vùng riêng biệt của protein đó [35]. Ví dụ, sự kích thích mitogen thƣờng khởi động một đáp ứng tế bào bằng cách kích hoạt tồn bộ các q trình phosphoryl hóa. Kích thích này đƣợc khởi động từ một thụ thể màng và lan nhanh vào tế bào qua q trình phosphoryl hóa các chất trung gian hay các cơ quan đáp ứng [25]. Nhƣ vậy, với vai trò trung tâm trong con đƣờng truyền tin và vận chuyển các chất của tế bào, protein màng là đích nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học.
Cấu trúc của hệ protein màng và độ phong phú của một số protein màng có thể biến đổi một cách có ý nghĩa trong sự biệt hóa tế bào cũng nhƣ trong các q trình
diễn tiến bệnh lí. Bởi vậy, các protein màng có thể là những chỉ thị sinh học tiềm năng cho sự phát triển và dự đốn về bệnh, hay cũng có thể là các đích thuốc hữu ích trong lâm sàng để ngăn chặn các dịng thác tín hiệu có liên quan đến sự phát sinh bệnh tật. Do đó, việc nhận biết và mơ tả các protein màng cũng nhƣ chức năng của chúng là rất thiết thực để tạo nên một bộ khung phân tử giúp hiểu rõ về sự truyền tín hiệu và tác động của các kích thích lên những con đƣờng tín hiệu này. Tiếp theo đó là nhiệm vụ cốt yếu trong việc khám khá ra các loại thuốc mới tốt hơn cùng với các chiến lƣợc tích cực trong việc điều trị nhiều căn bệnh phổ biến nhƣ là tim mạch.
1.2.2. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu protein màng
Trong sinh bệnh học, protein màng thƣờng đƣợc phân tích tồn diện theo tình trạng sức khỏe hay dƣới các điều kiện nhân tạo. Những nghiên cứu về protein màng chủ yếu tập trung theo hƣớng tiếp cận proteomics. Một vài nghiên cứu chính vừa đƣợc cơng bố gần đây đã thử nghiệm trên các mơ hình mơ ni cấy hoặc các dòng tế bào nhƣ tế bào gốc phôi ngƣời, tế bào ung thƣ buồng trứng, tế bào gan chuột, tế bào lympho B trong bệnh ung thƣ hệ bạch huyết, ung thƣ biểu mô thận.
Nghiên cứu về các protein màng sử dụng proteomics định lƣợng độ phân giải cao vẫn còn đang là một thách thức. Cản trở chính trong các phân tích này chính là các protein màng thƣờng thƣờng có nồng độ thấp do độ hịa tan kém. Hơn nữa, với các protein gắn màng, loại protein có chứa cả vùng ƣa nƣớc và kị nƣớc, thƣờng rất khó tinh sạch và xác định tính chất. Phần lớn các thử nghiệm làm giàu protein màng đều cho thấy sự thiếu hụt các thông tin thu đƣợc về protein màng. Phân tích này có thể đƣợc chia thành ba bƣớc thí nghiệm chính: làm giàu và tinh sạch protein màng, hịa tan hồn toàn các protein này, cuối cùng là phân tích, nhận diện và xác định tính chất. Hầu hết các phƣơng pháp tiếp cận thực nghiệm là làm giàu và tinh sạch màng cũng nhƣ các protein màng, với thách thức chính là sự hiện diện của các protein tạp nhiễm với hàm lƣợng cao hơn nhiều lần. Việc tách thành các phân đoạn nhỏ sẽ giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu và cải thiện khả năng phân tích một mẫu phức hợp
ban đầu. Điều này sẽ giúp tăng khả năng nhận diện các protein có độ phong phú thấp hay các protein nhất định đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Cách tiếp cận truyền thống trong tinh sạch màng là sử dụng phƣơng pháp tủa hóa học kết hợp với siêu li tâm theo gradient. Gần đây tinh sạch hai pha lỏng đã đƣợc ứng dụng để tách sơ bộ các protein màng từ não và gan chuột trƣớc khi sử dụng phân tích phổ khối lƣợng. Protein màng có thể đƣợc làm giàu từng phần bằng cách sử dụng nhiều bƣớc và kiểu li tâm khác nhau với dịch li giải tế bào, mô hay vi thể. Từ đó các protein màng đƣợc tách riêng từ các bào quan khác nhau dựa trên sự khác biệt về tỉ trọng của chúng. Năm 2005, Zhang và cộng sự đã sử dụng li tâm gradient tỉ trọng sucrose để phân tách các protein màng khỏi mô gan chuột, nhận diện đƣợc 88 protein gắn màng trong số 175 protein thu đƣợc [52]. Hơn nữa, các bƣớc rửa sử dụng pH hay muối có nồng độ cao cũng giúp loại bỏ các protein khơng mong muốn có nguồn gốc từ tế bào chất. Cũng trong năm đó, Foster và cộng sự kết hợp li tâm gradient bằng sucrose với tách chiết bằng natri carbonat để làm giàu protein màng trong các tế bào gốc trung mô ngƣời. Họ đã tìm đƣợc tổng số 463 protein trong đó có 122 là các protein gắn màng [22]. Tuy nhiên, ngay cả các nghiên cứu thành công nhất cũng chỉ ra rằng các phân đoạn protein màng đƣợc làm giàu bằng phƣơng pháp tinh sạch qua hai pha này đều bị ảnh hƣởng bởi sự có mặt đáng kể của các thành phần khơng mong muốn. Kết quả là rất khó để có thể tạo ra các dữ liệu so sánh biểu hiện giữa các mẫu nghiên cứu khác nhau. Các nghiên cứu gần đây đã chuyển hƣớng sang nghiên cứu các mẫu có sẵn ở dạng hịa tan. Do đó, sẽ tránh đƣợc các khó khăn liên quan đến việc hịa tan các protein màng. Huyết thanh chính là một mẫu tiềm năng theo hƣớng nghiên cứu này. Bên cạnh đó, áp dụng kĩ thuật phổ khối lƣợng, một kĩ thuật có độ nhạy cao và khả năng nhận diện protein trong một mẫu tổng thể mà không cần tách chiết ra từng loại protein riêng biệt sẽ đem lại những kết quả rất khả quan.
1.3. HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP
1.3.1. Bệnh động mạch vành và hội chứng mạch vành cấp
Tim là một nội quan có vai trị then chốt trong hệ thống tuần hoàn của cơ thể, hoạt động liên tục từ khi sinh ra cho đến khi chết. Để quá trình này diễn ra bình thƣờng, tim phải sử dụng một lƣợng máu giàu oxi rất lớn cung cấp bởi hai động mạch vành. Nếu có bất kì rối loạn nào xảy ra với động mạch vành đều gây ra những tác động nghiêm trọng do việc giảm lƣu lƣợng oxi và dinh dƣỡng đi nuôi cơ tim. Đây là nguyên nhân chủ yếu gây ra các cơn đau tim và có thể dẫn đến tử vong [54]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới thì các bệnh lí liên quan đến tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới với 17,3 triệu ngƣời chết vì căn bệnh này vào năm 2008 và dự đoán sẽ tăng lên 23,3 triệu ngƣời vào năm 2030 [57].
Bệnh động mạch vành (coronary artery disease) hay còn gọi là bệnh tim do động mạch vành (coronary heart disease) hoặc bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim (ischemic myocardial disease) thƣờng gặp trong các bệnh lí liên quan đến tim mạch. Mỗi năm Tổ chức Y tế Thế giới ƣớc tính có 3,8 triệu đàn ơng và 3,4 triệu phụ nữ chết vì bệnh động mạch vành. Tỉ lệ chết vì bệnh này đã giảm ở Bắc Mĩ và Tây Âu, nhƣng đang tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Ngƣời ta tính tốn rằng khoảng 82% tỉ lệ chết vì bệnh động mạch vành trong tƣơng lai sẽ xảy ra ở các nƣớc đang phát triển [36]. Ở Việt Nam tình hình bệnh động mạch vành cũng ngày đang tăng cao. Theo thống kê của Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai vào năm 1991 tỉ lệ mắc bệnh mạch vành chỉ chiếm 3% thì đến năm 1996 tỉ lệ này là 6,1% và đến năm 1999 đã lên đến 9,5% [3]. Trong số các hội chứng của bệnh mạch vành thì hội chứng mạch vành cấp (ACS) gần đây đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. ACS bao gồm đau thắt ngực không ổn định và dạng nguy hiểm hơn là nhồi máu cơ tim.
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh và phát triển bệnh tim mạch nói chung và ACS nói riêng. Các nghiên cứu về ACS do tác động của các yếu tố nguy cơ nhƣ đái tháo đƣờng, rối loạn lipid máu, hút thuốc lá, béo phì đã đƣợc nghiên cứu
nhiều trên thế giới cũng nhƣ ở nƣớc ta. Thêm vào đó một vấn đề đƣợc quan tâm trong vài năm gần đây là hội chứng chuyển hoá. Tùy theo các định nghĩa khác nhau nhƣng đều bao gồm các tiêu chí sau: béo phì dạng nam, rối loạn lipid máu, rối loạn dung nạp đƣờng máu và tăng huyết áp. Các nghiên cứu dịch tễ cho thấy ở ngƣời hội chứng chuyển hoá có nguy cơ mắc bệnh tim mạch do xơ vữa tăng gấp 2-3 lần. Thống kê cũng cho thấy ở Mĩ hội chứng chuyển hoá chiếm 25% ở độ tuổi trên 20 và gia tăng lên 45% ở độ tuổi trên 50 [27].
1.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đốn hội chứng mạch vành cấp
Có rất nhiều phƣơng pháp để chẩn đoán ACS: siêu âm nội mạch, chụp cắt lớp vi tính quang học, nội soi mạch hoặc đo lƣu lƣợng, áp lực nội mạch vành. Trong đó, chụp động mạch vành đƣợc xem là tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán bệnh động mạch vành trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam, ƣớc tính có khoảng 2.000.000 ca (trung bình khoảng 800 ca trên 100.000 dân) đƣợc thực hiện mỗi năm tại Hoa Kì [15]. Hiện tại chƣa có kĩ thuật hình ảnh nào khác hiển thị chi tiết việc lƣu thông mạch vành nhƣ kĩ thật này, tuy rằng những kĩ thuật không xâm lấn nhƣ chụp mạch cộng hƣởng từ, chụp cắt lớp vi tính đa diện và chụp cắt lớp tia điện tử đã đƣợc cải thiện khá nhiều về độ phân giải. Mặc dù vậy, chụp động mạch vành bị giới hạn khi chỉ xem lòng mạch vành mà không xem đƣợc bề mặt nội mô, bản chất mảng bám, thành mạch hay dịng chảy sinh lí động mạch vành. Hơn nữa, các bức xạ phát ra từ các thiết bị chụp trong một thời gian dài cũng gây nguy hại cho sức khỏe của các bệnh nhân. Để khắc phục mặt hạn chế này, các xét nghiệm sinh hóa đã ra đời với việc sử dụng các phƣơng pháp đo các dấu ấn tim trong máu. Trong những năm qua, hƣớng dẫn chẩn đoán và điều trị nhồi máu cơ tim cấp của Tổ chức Y tế Thế giới, của Hội tim mạch Hoa Kì, của Hội tim mạch châu Âu đƣợc cập nhật không ngừng mà các dấu ấn tim là nền tảng của những thay đổi đó. Từ những năm 50 cho đến nay, đã có rất nhiều dấu ấn tim khác nhau đƣợc sử dụng trong hội chứng mạch vành cấp nhƣ Aspartate Aminotransferase của thập niên 50, các đồng phân và đồng đẳng Creatine kinase (CK) của thập niên 60, Myoglobin của thập niên 70 và gần đây nhất
là các troponin tim [10], [53]. Hiện tại, dấu ấn sinh hóa tim lí tƣởng cho hội chứng mạch vành cấp vẫn còn tiếp tục đƣợc nghiên cứu.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ PROTEIN MÀNG VÀ TIM MẠCH
1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới
Gần đây, những nghiên cứu proteomics về các bệnh lí tim mạch đang tập trung nhiều vào việc phân tích về các protein màng với những cải tiến về kĩ thuật trong việc làm giàu các protein này. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng quan tâm đến việc tìm hiểu hệ protein của các cấu trúc dƣới tế bào và các hệ thống sinh học để tìm kiếm các chỉ thị bệnh có giá trị. Đa phần các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên mơ hình chuột. Kislinger và cộng sự vào năm 2006 đã thực hiện phân đoạn các thành phần cấu tạo nên tế bào của rất nhiều loại mô bao gồm cả mô tim chuột và kết hợp với các phân tích khối phổ. Tác giả đã thu đƣợc 1652 protein tim, tuy nhiên số lƣợng protein màng tế bào thu đƣợc lại ít hơn mong đợi [29]. Một nghiên cứu khác tiến hành vào năm 2011 của Parker cũng đã nhận diện đƣợc 1556 vị trí glycosyl hóa liên kết đầu N (N-linked) đại diện cho 972 nhóm protein từ các protein tim chuột. Trong số đó, 650 protein đƣợc dự đốn là có vùng xun màng. Các phân tích cũng hé lộ rằng có tới 76,9% các protein đã đƣợc nhận diện cho thấy chúng định vị trên màng [43].
Điện di hai chiều giữ vai trò quan trọng trong các nghiên cứu proteomics. Với khả năng phân tách protein theo cả điểm đẳng điện và khối lƣợng nên kĩ thuật này rất hữu hiệu trong việc phát hiện ra các cải biến sau dịch mã – nhân tố làm biến đổi giá trị đẳng điện cũng nhƣ khối lƣợng protein. Tuy vậy, hạn chế chủ yếu của kĩ thuật này chính nằm ở phạm vi phân tích. Điện di hai chiều chỉ giới hạn trong tầm
hoạt động khoảng 104
so với độ đa dạng rất lớn của các protein trong tế bào hay mô (106), và đặc biệt là trong huyết thanh (1012). Để vƣợt qua vấn đề này cần phải làm đơn giản hóa các mẫu và điển hình nhất là nghiên cứu trên từng phần dƣới tế bào thay vì nghiên cứu tồn bộ tế bào. Tuy vậy, điện di hai chiều vẫn có một nhƣợc
điểm nữa trong nghiên cứu các protein màng. Đó là các protein màng rất khó hịa tan trong đệm điện di đẳng điện. Vấn đề này có thể khắc phục bằng điện di một chiều kết hợp LC-MS/MS trong phân tích tổng thể [44]. Trên cơ sở đó, Franklin đã tách chiết phần nhân tế bào tim của chuột,sau đó phân đoạn thành những phần nhỏ hơn nhƣ phần protein tan trong acid, protein liên kết chất nhiễm sắc, protein chất nền của nhân. Sử dụng phân tích proteomics tác giả đã nhận diện đƣợc 1048 protein trong đó có 142 protein có vùng xuyên màng. Xa hơn, sử dụng kĩ thuật phổ khối lƣợng độ chính xác cao để tìm các peptide tƣơng ứng với tồn bộ 54 biến thể của histone kết quả cũng cho thấy có 17 trong số đó đƣợc nhận diện bằng một peptide đặc trƣng duy nhất [23].
1.4.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam
Năm 2010, Trần Thế Thành cùng cộng sự đã tiến hành tách chiết protein màng từ mơ gan chuột, sử dụng sắc kí lỏng kết nối khối phổ đã nhận diện đƣợc 318 protein màng. Trong đó có 212 protein (66,67%) có ít nhất một vùng xuyên màng đƣợc dự đốn bằng chƣơng trình SOSUI [46]. Năm 2013, Nguyễn Tiến Dũng đã sử dụng phƣơng pháp tƣơng tự khi phân tích mơ não chuột và truy vấn trên cơ sở dữ liệu UniProt cũng tìm thấy 298 protein màng. Sau khi kết hợp hai công cụ tin sinh là SOSUI và TMHMM tác giả cũng dự đoán đƣợc 129 protein trong số đó (43,3%) có vùng xuyên màng [21]. Gần đây nhất Nguyễn Thị Minh Phƣơng dựa trên cách tiếp cận proteomics trong nghiên cứu so sánh mức độ biểu hiện của các protein bền nhiệt trong huyết thanh bệnh nhân ACS. Kết quả đã phát hiện đƣợc 19 protein có mức độ biểu hiện thay đổi, trong đó có 7 protein chỉ biểu hiện tăng, 3 protein chỉ
biểu hiện giảm và 9 protein biểu hiện thay đổi lúc tăng lúc giảm [6]. Tuy vậy, các
nghiên cứu protein màng tổng thể trên đối tƣợng con ngƣời mà cụ thể là huyết thanh vẫn chƣa có nhiều. Do đó, chúng tơi đã thực hiện nghiên cứu này nhằm xây dựng dữ liệu protein màng để làm tiền đề cơ bản cho những nghiên cứu ứng dụng về ACS trong tƣơng lai.
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là huyết thanh của 30 bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp đƣợc cung cấp từ Viện Tim mạch thuộc Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Các mẫu đƣợc lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng. Mẫu đƣợc bảo quản ở -