Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ

2.2. PHƢƠNG PHÁP

2.2.5. Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ

Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân trong trong gel đƣợc hịa vào FA 1% và phân tích trên hệ sắc kí lỏng Nano. Đối với hỗn hợp peptide phức tạp tạo ra do thủy phân protein trong các phân đoạn gel, tiến hành chạy 2 chiều (qua cột trao đổi ion SCX và cột RP C18) với 16 phân đoạn, 60 phút/mỗi phân đoạn.

Hệ sắc kí lỏng nano

Các loại cột với đƣờng kính mức m đƣợc sử dụng cho hệ NanoLC theo nguyên lý ngƣợc pha C18 (75 m x 15 cm), hoặc trao đổi ion SCX (500 m x 1,5 cm),

đƣờng kính dây nối là 20 m.

Các peptide đƣợc phân tách theo chiều thứ nhất trên cột sắc kí trao đổi ion SCX (LC Parking, Dionex, Hoa Kì) bằng các chất trao đổi cation mạnh. Peptide đƣợc đƣa vào với thể tích 20 l thơng qua hệ đƣa mẫu tự động và đƣợc đƣa lên cột SCX (500 m x 15 mm) với tốc độ dòng 30 l/phút bằng 0,1% FA. Các peptide bám trên

cột SCX đƣợc thôi ra bằng 16 phân đoạn muối CH3COONH4 có nồng độ từ 0 đến

1M. Peptide thơi ra từ cột SCX đƣợc cô đặc và loại muối trên cột ngƣợc pha (300

m x 1,5 cm) trƣớc khi phân tách trên cột RP-C18 với chiều dài 15 cm. Sắc ký

chiều thứ hai đƣợc thực hiện trên cột ngƣợc pha C18 15 cm với pha linh động A (0,1% FA) và B (0,1% FA trong 85% ACN). Các peptide đƣợc thôi ra với tốc độ dòng là 0,2 l/phút theo gradient tuyến tính từ 5-100% dung dịch B trong 60 phút. Các phân tích khối phổ đƣợc thực hiện sử dụng hệ thống QSTARXL MS/MS (Applied Biosystems/MDS Sciex, Ontario, Canada) đƣợc trang bị với nguồn ion hóa bằng phun điện (ESI).

Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS

Máy khối phổ QSTARXL đƣợc vận hành ở chế độ Information Dependent

Acquisition để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 đƣợc xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS phiên bản 1.1 (Applied Biosystems, Hoa Kì). Sai số về khối đƣợc đặt ở mức ± 0,25 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây. Hiệu điện thế đƣợc đặt ở nguồn để ion hóa mẫu là 2200V.