CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium
2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium
Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glyxerol lên đĩa mơi trƣờng YEP thạch có bổ sung spectinomycine 50 mg/L, ni ở 280
C trong 36-48 giờ. Sau đó lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong 5ml môi trƣờng YEP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi ở nhiệt độ 280C, sau 8 giờ, chuyển tồn bộ 5ml dịch ni cấy trên sang 45ml mơi trƣờng YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine ni lắc 220 vịng/phút ở nhiệt độ 280C, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 40
C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hồ tan cặn với mơi trƣờng 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD600 0.5- 0.9. Dịch huyền phù vi khuẩn này có thể đƣợc sử dụng để biến nạp ngay hay có thể giữ ở 40
C trong 1-2 giờ.
2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá
Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 1cm2. Những mảnh lá, cuống lá và các chồi này sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phịng sau đó đƣợc đặt lên mơi trƣờng WPM nuôi trong tối 48 giờ, ở nhiệt độ 260
C
20
C.
Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng các mảnh lá đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc.
2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.
Thƣờng sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào [11], [20]. Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4- Cl-3indolyl vẫn cịn là một chất dễ tan, khơng màu. Nhƣng ngay sau đó sản phẩm này bị ơxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ khơng tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng khơng có gus [3].
Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen đƣợc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm đƣợc tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trƣng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
Nhuộm gus đƣợc thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm gus cũng để khẳng định gen chuyển đƣợc di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phơi của hạt hình thành từ cây chyển gen.
2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số
Các mảnh lá, cuống lá, chồi đƣợc nuôi trên môi trƣờng chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các dịng rễ trắng, đầu rễ khơng bị thâm đen, sinh trƣởng tốt để chuyển sang nuôi cấy lỏng trên mơi trƣờng WPM lỏng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime, rễ đƣợc nuôi lắc 80 vòng/phút ở nhiệt độ 260
C. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số.
Các mẫu sinh khối rễ đƣợc tách và tinh sạch DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và Jarret (1991).
2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Từ đó đến nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong cơng nghệ sinh học và đã góp phần to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung, của các nucleotid tự do với DNA khn, và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần.
Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và chu kỳ nhiệt trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồi của cặp mồi đã đƣợc thiết kế.
Trình tự các cặp mồi cry3 và virC đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes
cry3_F 5‘-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3‘ cry3_R 5‘-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3‘ virC_F 5'-ATCATTTGTAGCGACT-3' virC_R 5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3' Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc deion khử trùng 12,5 2 Buffer 10x 2,5 3 dNTPs 2,0 4 DNA 5,0 5 Taq polymerase 1,0 6 Primer F 1,0 7 Primer R 1,0 Tổng 25
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Số chu kỳ
1 Biến tính 95 180 1
2 Biến tính 93 30
35
3 Gắn mồi 52 30
4 Kéo dài chuỗi 72 70
5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên máy soi gel quả trên máy soi gel
Phƣơng pháp điện di trên gel agrose đƣợc sử dụng để kiểm tra kết quả DNA tổng số, kiểm tra các phân đoạn DNA đƣợc nhân bằng kĩ thuật PCR…
Agarose 0,8% đƣợc đun sôi, tiếp đến đƣợc hạ nhiệt độ xuống 500
– 600C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông cứng, tiến hành tháo lƣợc, đặt khay gel vào bể điện di. Bổ xung đệm TAE 1X vào bể sao cho gel ngập trong đệm khoảng 2mm.
Tra mẫu: Mẫu DNA đƣợc mix cùng với dye 6x, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.
Tiến hành điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100-130V, cƣờng độ dòng điện 60 – 80mA, đến khi vệt màu của bromophenol blue cách mép bản gel 1-2cm thì kết thúc điện di.
Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10g/ml) trong thời gian 20 phút.
Quan sát và chụp ảnh: Gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp trên máy Bio – Rad với tia UV ở bƣớc sóng 320nm.