Mật độ tế bào vi khuẩn (OD) Tổng số mẫu Số mảnh cấy bắt màu
xanh khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 0,5 100x3 14 13 14 13,67+0,33 13,67+0,33 0,6 100x3 17 19 22 19,33+6,33 19,33+6,33 0,7 100x3 29 30 32 30,33+2,33 30,33+2,33 0,8 100x3 36 35 38 36,33+2,33 36,33+2,33 0,9 100x3 22 20 25 22,33+6,33 22,33+6,33
Theo bảng trên cho thấy kết quả dƣơng tính khi nhuộm gus cao nhất đối với dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 = 0,8 đạt 36,33%. Giá trị OD này nằm trong giới hạn của nhiều tác giả sử dụng biến nạp gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Luo H. R & CS (2008) biến nạp gen vào khoai tây bằng chủng A. tumefaciens EHA105 có OD từ 0,6 đến 0,8. Marceline Egnin & CS (1998) tiến hành
(2004) lại sử dụng OD có giá trị từ 0,8 đến 1,0 để biến nạp vào khoai lang. Nhƣ vậy hiệu quả chuyển gen gus còn phụ thuộc vào chủng vi khuẩn cũng nhƣ loại thực vật đích [38], [52], [54]. Với α=0,05 kết quả cho thấy sự khác biệt trong hiệu quả biến nạp giữa các giá trị OD là có ý nghĩa. Chúng tơi sử dụng mật độ tế bào vi khuẩn có giá trị OD600 = 0,8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
A B
Hình 3.1. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Mẫu lá âm tính B. Mẫu lá dƣơng tính (chuyển xanh do gen Gus)
3.1.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng (AS) đến khả năng biến nạp
AS là hợp chất của phenol, có tác dụng dẫn dụ, tăng cƣờng sự lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium, cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T-DNA vào tế
bào thực vật. Trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng AS đến khả năng biến nạp của Agrobacterium vào khoai lang. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau.
Dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc pha loãng đến OD600 = 0,8 sau đó bổ sung thêm lần lƣợt 0µM; 100 µM; 150 µM; 200 µM AS vào dịch huyền phù vi khuẩn. Các mảnh lá làm tổn thƣơng đƣợc ngâm vào dịch huyền phù vi khuẩn trên trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian lây nhiễm mẫu đƣợc thấm
khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy chọn ngẫu nhiên 100 mảnh lá để nhuộm với X-Gluc ở 370
C trong 8- 12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn để xác định biểu hiện của gen gus. Kết quả đƣợc
thể hiện trong bảng sau.