Nồng độ AS (µM)
Tổng số mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 100x3 30 32 32 31+1,33 31+1,33 100 100x3 39 42 40 40,33+2,33 40,33+2,33 150 100x3 40 38 41 39,67+2,33 39,67+2,33 200 100x3 39 42 42 41,00+3,00 41,00+3,00
Kết quả bảng trên cho thấy khi bổ xung thêm AS vào biến nạp thì hiệu quả biến nạp tăng lên rõ rệt giữa mẫu đối chứng với các mẫu có sử dụng AS. Tuy nhiên giữa các mẫu có bổ xung AS thì sự khác nhau trong hiệu quả biến nạp là không nhiều (α=0,05). Vì vậy để giảm chi phí trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn bổ xung AS có nồng độ 100µM vào mơi trƣờng biến nạp cho các thí nghiệm chuyển gen cry. Theo Rolando García González & CS (2008) các hợp chất phenolic tiết ra
từ các mô thực vật bị tổn thƣơng và AS là những hợp chất quan trọng ảnh hƣởng đến biểu hiện của gen vir và tới hiệu quả chuyển T-DNA của Agrobacterium, bên
cạnh đó ảnh hƣởng của AS tới hiệu quả chuyển gen còn phụ thuộc vào nhiệt độ, kiểu gen bị biến đổi. Nồng độ AS tối ƣu sử dụng trong biến nạp khoai lang xác định bởi Newell & CS (1995), Pineda & CS (2002) là 200µM. Otani & CS (1998) ở 50µM. Tuy nhiên, trái ngƣợc với kết quả của chúng tôi, Khanna và Raina (1999) cho rằng ở nồng độ 400-500μM AS sẽ làm tăng hiệu quả chuyển gen ở lúa gạo, nhƣng Jinjuan shen & CS (2012) lại sử dụng AS ở nồng độ 100 µM cho biến nạp ở
Japonica rice H02-117. Hơn nữa, AS không chỉ đƣợc sử dụng tăng hiệu quả biến
nạp gen cho khoai lang mà cịn đƣợc sử dụng trong lúa mì. Mc Cormac &CS (1998) sử dụng 100μM AS, trong khi đó Hamid Rashid &CS (2010) đã sử dụng 150μM AS để nâng cao hiệu quả chuyển gen của Triticum aestivum L. cv. Inqilab-91. Amoah &CS (2001) lại sử dụng AS ở nồng độ 200μM để tăng hiệu quả biến nạp ở lúa mì.
A B
Hình 3.2. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Rễ âm tính B. Rễ dƣơng tính (chuyển xanh do gen gus)
3.2. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens
Cry3 là gen mã hóa cho mã hóa protein hình thoi có trọng lƣợng 66-73 kDa,
có tác dụng gây độc với ấu trùng thuộc bộ hai cánh. Sau khi thử nghiệm các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng biến nạp của A. rhizogens với khoai lang thông qua biểu
hiện tạm thời của gen gus. Chúng tôi tiến hành biến nạp gen cry3 vào khoai lang với các điều kiện tối ƣu đã đƣợc xác định ở trên.
Giống khoai lang KB1 ni cấy invitro có tuổi từ 7 đến 13 ngày. Các mơ lá đƣợc cắt thành các mảnh có kích thƣớc 1x1cm, cuống lá, chồi ngọn đƣợc cắt thành các đoạn có chiều dài 1cm. Các mơ trên đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang vector pIBT/cry3 có OD600=0,8 bổ xung thêm 100µM AS, trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian lây
nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy, đƣợc giữ trong tối ở nhiệt độ 26+20
C. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/L và kanamycine 50mg/L để loại bỏ vi khuẩn cịn sót trên mẫu. Mẫu đƣợc ni dƣới ánh sáng trắng có cƣờng độ 2000lux với thời gian chiếu sáng 12giờ/ ngày
Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc, lựa chọn các dòng rễ trắng, phân nhánh nhiều, đầu rễ không bị đen, sinh trƣởng tốt đƣợc cắt và chuyển sang nuôi lắc với tốc độ 80 vịng/phút trên mơi trƣờng chọn lọc WPM lỏng có bổ sung cefotaxime 500mg/L và kanamycine 50mg/L. Sau 30-45 ngày nuôi cấy lỏng trong mơi trƣờng chọn lọc, chọn lựa các dịng sinh khối rễ sinh trƣởng tốt mang đi tách, tinh sạch DNA tổng số và kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
3.2.1. Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 pIBT/cry3
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogens, mẫu lá đƣợc đặt trên môi
trƣờng chọn lọc WPM. Tỷ lệ chọn lọc sơ bộ của các mẫu trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc thể hiện qua bảng.
Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ của các mẫu trên mơi trƣờng chọn lọc có cefotaxime 500 mg/L và kanamycine 50mg/L sau khi nhiễm với A. rhizogens và mẫu đối chứng
Thí nghiệm Tổng số mẫu Số mô sống sau 1 tuần Số mô sống sau 2 tuần Số mô sống sau 3 tuần Số mô sống sau 4 tuần Số mô cảm ứng tạo rễ Biến nạp 300 235 197 149 103 18 Đối chứng 50 0 0 0 0 0
Qua bảng trên, chúng tôi nhận thấy ở mẫu đối chứng các mẫu bị vàng và chết ở ngay tuần đầu tiên khi nuôi trên môi trƣờng chọn lọc. Ở mẫu biến nạp các mô sống sót trên mơi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả
năng những mẫu tồn tại và phát triển đƣợc là những mô mang các tế bào đã đƣợc chuyển gen. Tuy nhiên, chúng tôi cũng nhận thấy một số lƣợng lớn các mô sống sót và phát triển trên mơi trƣờng chọn lọc nhƣng khơng cảm ứng tạo rễ. Các dịng rễ tơ này tiếp tục đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng nuôi cấy lỏng tạo sinh khối để tách DNA và kiểm tra bằng phản ứng PCR.
A B
C D
Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang KB1
A. Mẫu lá đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
B. Mẫu lá biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
C. Mẫu rễ đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
D. Mẫu rễ biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
3.2.2. Kết quả tinh sạch DNA khoai lang tổng số
Các dòng sinh khối rễ sau khi nuôi lỏng 4 tuần để tiếp tục chọn lọc đƣợc rửa sạch, làm khô bằng máy hút chân không Savant. Các mẫu đƣợc sử dụng để tách và tinh sạch DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và Jarett (1991).
DNA tổng số của các mẫu đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm Ethidium Bromide và quan sát kết quả trên máy soi gel (Bio-Rad).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra tách DNA tổng số
M: marker 1kb; 1-12: Các dòng rễ tơ khoai lang.
Kết qua cho thấy chúng tôi đã tách thành công DNA tổng số trên 12 dòng rễ tơ khoai lang KB1. DNA tổng số đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A. rhizogens
Để đánh giá hiệu quả biến nạp vào khoai lang, ngồi đặc điểm hình thái rễ tơ thì việc kiểm tra sự hiện diện các gen đích trong các dịng rễ tơ bằng phản ứng PCR là cần thiết để đánh giá chính xác.
DNA sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện diện của gen cry3 trong rễ cây khoai lang với cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm sau phản ứng PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
+ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dƣơng sử dụng vector pIBT/cry3 1-12: Các dòng rễ khoai lang.
Qua hình 3.5 cho thấy, trong 12 dịng khoai lang thí nghiệm chỉ có 2 dịng cho kết quả dƣơng tính (mẫu 8 và 9), xuất hiện một băng vạch có cùng kích thƣớc với đối chứng dƣơng cho thấy sự có mặt của gen cry3. Các dòng còn lại
đều cho kết quả âm tính.
Các gen vir có vai trị quan trọng trong q trình lây nhiễm và chuyển gen ở vi khuẩn Agrobacterium vào thực vật. Biểu hiện của gen vir trong các mô thực vật chỉ thị cho sự hiện diện hay không của vi khuẩn Agrobacterium trong các mô sau biến nạp [65].
Để khẳng định kết quả biến nạp gen cry3 thành công vào khoai lang, cùng với kiểm tra sự hiện diện của gen cry3, chúng tôi đồng thời tiến hành kiểm tra sự hiện diện của gen vir trong 12 dòng rễ tơ bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc
941bp
1000bp 750bp
hiệu, để xác định sự có mặt của plasmid hoặc vi khuẩn A. rhizogens còn nhiễm
trong các mô, trong môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi virC đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - +
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dƣơng với vi khuẩn A. rhizogens 1-12: Các dòng rễ khoai lang.
Qua kết quả thu đƣợc ở trên, cho thấy: trong 12 dòng rễ tơ đƣợc kiểm tra sự hiện diện của gen vir bằng phản ứng PCR chỉ có có 01 mẫu (mẫu 8) cho kết
quả dƣơng tính. Nhƣ vậy dòng rễ tơ số 8 vẫn còn sự hiện diện của vi khuẩn A. rhizogens trong mơ sau biến nạp.
Từ hình 3.6 và 3.7 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành cơng gen cry3
vào 01 dịng khoai lang KB1 (mẫu 9). Đây chính là cơ sở, nguồn nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
~700bp 750bp
3.3. Kết quả tách protein tổng số
Protein cry3 có hình thoi có trọng lƣợng 66-73 kDa, có tác dụng gây độc với ấu trùng thuộc Bộ Hai cánh [86]. Các dòng rễ tơ khoai lang có kết quả PCR dƣơng tính, sau 30-45 ngày ni cấy invitro trong môi trƣờng WPM lỏng, đƣợc sử dụng để tách protein tổng số theo phƣơng pháp trong mục 2.3. Hàm lƣợng protein tách chiết đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford 1976.
Để xác định hàm lƣợng protein trong mẫu, trƣớc tiên chúng tôi tiến hành xây dựng phƣơng trình tuyến tính giữa nồng độ protein chuẩn và các giá trị OD595 tƣơng ứng đo đƣợc. Với hệ số tƣơng quan R2
= 0,98748. Chúng tơi thu đƣợc phƣơng trình tuyến tính nhƣ sau.
Y = 0,2748x + 0,022
Từ phƣơng trình tuyến tính trên và các giá trị OD595 đo đƣợc từ các mẫu chúng tơi xác định đƣợc hàm lƣợng protein có trong các mẫu đƣợc trình bày trong bảng sau. Bảng 3.5. Hàm lƣợng protein trong các dòng KB1 Mẫu OD595 Protein (mg/ml) 1 0,000 0,00 2 0,071 0,25 3 0,173 0,50 4 0,345 1,00 5 0,689 2,50 6 0,113 0,404 7 0,272 0,910
Trong đó: Từ mẫu 1 đến 5: protein chuẩn BSA
Mẫu 6: Dòng khoai lang có kết quả PCR âm tính Mẫu 7: Dịng khoai lang có kết quả PCR dƣơng tính
Qua bảng trên cho thấy protein trong mẫu có hàm lƣợng lần lƣợt là 0,404 và 0,910mg/ml. Hàm lƣợng chất dinh dƣỡng và protein tích lũy trong rễ phụ thuộc
nhiều vào điều kiện sinh trƣởng của khoai lang nhƣ thời gian, cƣờng độ chiếu sáng, biến động của nhiệt độ, môi trƣờng nuôi cấy … [12], [88]. Đồng thời các yếu tố nhiệt độ, các chất hòa tan… cũng ảnh hƣởng tới kết quả tách chiết protein trong các mẫu thực vật [4]. Các mẫu protein thu đƣợc từ trên đƣợc sử dụng trong đánh giá hoạt lực diệt côn trùng lên sâu non bọ hà.
3.4. Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp
Sâu non và sâu trƣởng thành của bọ hà khoai lang đều gây hại, song chủ yếu là sâu non. Sâu non bọ hà vừa nở ra đục ngay vào phần thịt của củ tuy nhiên sâu mới nở thƣờng rất mềm yếu, kích thƣớc cơ thể nhỏ rất khó thao tác cho thí nghiệm. Để kết quả thí ngiệm đƣợc chính xác, thuận lợi trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn sâu non bọ hà tuổi 2 để tiến hành thử sâu hoạt lực của protein thu đƣợc, do sâu non bọ hà tuổi 2 có sức đục mạnh hơn, cơ thể dài khoảng 6-7mm, có mầu nâu nhạt dễ quan sát và thuận lợi cho thao tác cho thí nghiệm [11].
Protein thu đƣợc sau khi tách chiết, xác định hàm lƣợng đƣợc tiến hành thử hoạt tính diệt sâu non bọ hà tuổi 2. Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo mục 2.5.3. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần thử với 3 sâu non bọ hà tuổi 2. Cách 2 ngày kiểm tra kết quả một lần, sau 4 ngày bắt đầu xuất hiện sâu chết ở một số giếng. Sau 14 ngày kết quả thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.6. Hoạt lực diệt côn trung của protein lên sâu non bọ hà Dịng Dịng rễ tơ Protein (µg/giếng) Tổng số sâu thử Số sâu chết Tỷ lệ trung bình sâu chết (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 0 3x3 0 0 1 11,11+0,03 2 20 3x3 0 0 0 0,00+0,00 40 3x3 0 1 0 11,11+0,03 3 20 3x3 1 1 0 22,22+0,03 40 3x3 2 2 2 66,67+0,00
2: Mẫu có kết quả PCR âm tính với gen cry 3 3: Mẫu có kết quả PCR dƣơng tính với gen cry 3
Qua bảng trên cho thấy, với hàm lƣợng protein 20µg và 40µg/giếng tỷ lệ sâu chết ở mẫu 3 là tƣơng đối nhỏ. Theo nghiên cứu của Sheng-Jiun Wu &CS (2012) liều lƣợng gây chết ở LD50 của protein cry3A lên ấu trùng bọ cánh cứng
Tenebrio molitor là 11,4µg/ấu trùng. Ekobu & CS (2010) khi thử hoạt lực diệt sâu
của protein Cry3Ca1 với các loại sâu của 2 loài Cylas puncticollis và Cylas brunneus có liều lƣợng chết trung bình (LC50) là 1µg/g thức ăn. Youngjin &CS (2009), hoạt lực diệt bọ cánh cứng của protein Cry3A, Cry3B có liều chết trung bình (LC50) trong khoảng 0,7- 13,0µg/cm2. Trong khi theo Selvapandiyan & cs (2001) khi thử hoạt lực diệt sâu của protein vip3V với các loại sâu khác nhau thuộc Bộ Cánh vảy có liều lƣợng chết trung bình dao động trong khoảng từ 5-2000 ng/cm2. Tuy nhiên điều này có thể do protein chiết trong thí nghiệm chƣa đƣợc tinh sạch, tách riêng protein độc, protein sử dụng dƣới dạng protein thơ. Cũng có thể do sâu ăn ít thức ăn nên lƣợng độc tố chƣa đủ làm chết sâu.
Trong thực tế nghiên cứu, tỷ lệ của sâu non chết ít, khơng đồng đều khi tiến hành thử nghiệm cùng một nồng độ độc tố còn phụ thuộc nhiều vào cách bố trí, thao tác thí nghiệm, mơi trƣờng ni sâu và chất lƣợng sâu non đem thử. Theo một số nghiên cứu của Cao-guo & CS (1997), Selvapandiyan và CS (2001), khi tiến hành thí nghiệm thử protein độc với sâu xám (Agrotis ypsilon) các tác giả đã xác định trọng lƣợng của sâu trƣớc và sau khi thí nghiệm với kích thƣớc sâu non ban đầu là 30-40mm. Tuy nhiên trong thí nghiệm ở đây, do sâu non bọ hà tuổi 2 rất nhỏ kích thƣớc cơ thể dài khoảng 6-7mm nên việc thao tác gặp nhiều khó khăn, vì vậy chúng tôi chỉ quan sát sự phát triển của sâu non bằng hình thái bên ngồi. Do vậy dựa theo kết quả (bảng 3.6) chúng tôi tạm kết luận protein tách từ dịng khoai lang dƣơng tính với gen cry3 có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà.
Sâu non ở mẫu đối chứng (trái) và mẫu 2 (phải) (dịng rễ tơ âm tính với gen cry3)
Sâu non chết ở mẫu 3 (dịng rễ tơ dƣơng tính với gen cry3)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận
- Xác định đƣợc điều kiện thích hợp cho q trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus.
Thời gian biến nạp: 20 phút Thời gian đồng nuôi cấy: 2 ngày
Nồng độ chất cảm ứng AS bổ xung vào huyền phù vi khuẩn: 100µM OD huyền phù vi khuẩn: 0,8
- Bƣớc đầu đã thu nhận đƣợc 01 dòng khoai lang KB1 mang gen cry3
kháng bọ hà.
- Bƣớc đầu đã xác định đƣợc protein tạo thành từ dòng khoai lang chuyển gen cry3 có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà tuổi 2.