Phân loại độc tố cry

Gene Hình dạng tinh thể độc Trọng lƣợng protein (kDa) Tác động lên cơn trùng

Cry I [phân nhóm: A(a), A(b),

B, C, D, E, F, G] Thoi 130-160 Bộ cánh vảy Cry II [phân nhóm A, B, C] Tháp 68-71 Bộ cánh vảy, hai cánh Cry III [phân nhóm A, B, C] Thoi 66-73 Bộ hai cánh

Cry IV [phân nhóm A, B, C, D] Thoi/tháp 72-135 Bộ hai cánh Cry V-IX Nhiều loại 35-129 Nhiều loại

1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác

Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xƣơng

sống và không xƣơng sống, hồng cầu động vật có vú. Gen này mã hố protein có trọng lƣợng khoảng 27kDa (trình tự không đồng nhất với bất kì gen cry nào) và

hoạt tính chống cơn trùng của protein này vẫn chƣa đƣợc xác định rõ. Theo một số nghiên cứu cho thấy protein này kết hợp vói một số protein do gen cryI mã hố tạo ra phức hợp tinh thể hình trứng có tác dụng độc với cơn trùng [74].

Nhóm gen vip (Vegetative Insecticidal Protein): Ngoài các gen cry tạo độc tố trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, cịn có nhiều hƣớng

nghiên cứu mới về gen vip. Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh dƣỡng trong chu trình phát triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt cơn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein độc do gen cry mã hóa [46]. Theo Nguyễn Trung Nam & CS sau khi sàng lọc 290 chủng Bt để tìm ra các chủng có hoạt tính diệt cơn trùng nhận thấy: Hoạt lực diệt côn trùng của dịch nuôi cấy Bt ở pha log của sự phát triển tế bào vi khuẩn (trƣớc 30h) cao hơn dịch nuôi cấy ở pha tạo bào tử (72h); Số chủng Bt có hoạt tính diệt sâu ở pha log nhiều hơn so với số chủng có hoạt tính diệt sâu ở pha tạo bào tử và thời gian diệt sâu của các chủng này cũng ngắn hơn [11], [25].

Một số gen vip nhƣ vip1, vip2 và vip3 đã đƣợc nghiên cứu sâu về mặt phân tử và khả năng biểu hiện protein độc tố ở nhiều chủng khác nhau và các gen này đã đƣợc nhân dòng bằng kỹ thuật PCR [50]. Theo nghiên cứu của Victor & CS (2002), protein Vip3 có kích thƣớc khoảng 88,6 kDa và có hoạt tính kháng sâu xám (Agrotis ypsilon) cao gấp 260 lần so với protein CryIA và có phổ hoạt động rộng kháng một số lồi cơn trùng Bộ Cánh vảy nhƣ sâu xám, sâu cắn chồi thuốc lá (Heliothis virescens) và sâu xanh hại ngô (Helicoverpa zea). Trong khi đó, Selvapandiyan & CS (2001) đã xử lý dột biến mất đoạn đầu C và N của protein Vip nhằm mở rộng phổ hoạt động diệt côn trùng kháng lại nhiều loài sâu khác nhƣ sâu đục củ khoai tây (Phthrimea opercullelar), sâu đục thân ngô (Chilo partellus), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ hại cải bắp (Plutella xylostella). [67], [78].

Về cơ chế tác dụng độc của các loại protein Vip cũng đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu cho thấy giống nhƣ phƣơng thức tác dụng của tinh thể độc - endotoxins. Tuy nhiên protein Vip có hoạt lực sau 48-72 giờ sau khi ăn protein độc, trong khi với protein Cry là 16-24 giờ [84].

Một số nghiên cứu về mặt phân tử cho thấy có sự liên quan giữa gen vip và

gen cry. Theo nghiên cứu của Sylvain & CS (2002), sự tiết một lƣợng lớn của

ngoại độc tố  liên quan đến sự có mặt của cry1B và vip2. Tác giả đã phân lập và

nghiên cứu 640 chủng Bt tự nhiên và nhận thấy các chủng mang gen cry1B và vip2 nằm trên cùng một plasmid là yếu tố di truyền cần thiết làm tăng lƣợng -exotoxin I ngoại bào [74].

Gần đây, đã có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động, hoạt lực diệt côn trùng, phổ tác dụng về gen vip để tiến tới phân lập và thiếp kế tạo vector chuyển gen vào thực vật. Theo các nhà khoa học việc tìm ra các gen vip có hoạt tính diệt cơn

trùng mạnh và ứng dụng để tạo ra cây chuyển gen có tính kháng sâu và phổ tác động rộng hơn là vấn đề đang đƣợc quan tâm của nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới [6], [67], [74], [78], [84].

1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng

Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lƣợng khơ của tế bào có bản chất là protein, đƣợc tổng hợp trong pha cân bằng của Bt. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu dƣới kính hiển vi đối pha tinh thể độc, chúng bền với nhiệt nhƣng lại bị mất hoạt tính khi bảo quản lâu, tiếp xúc với focmandehit 20% hay tia tử ngoại do tinh thể độc bị biến dạng hoặc bị phân hủy.

Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A

(nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html)

Cấu trúc không gian 3 chiều của 4 loại - endotoxin (Cry 1, Cry 2, Cry 3 và Cyt 2A) đƣợc ngiên cứu bằng kỹ thuật chiếu xạ tia X [36], [47], [48]. Protein Cry 1, Cry 2, và Cry 3 có cấu trúc tƣơng tự nhau, mỗi loại đều bao gồm 3 vùng chính.

Vùng I là đầu N, gồm 7 chuỗi xoắn α. Trong đó 6 chuỗi xắn ngồi bao gồm vùng ƣa nƣớc và kỵ nƣớc quấn quanh một chuỗi xoắn trung tâm. Vùng II bao gồm 3 phiến gấp  đƣợc lặp lại 3 lần, có tính đối xứng, cấu trúc nhƣ vậy của vùng II đƣợc gọi là cấu trúc ―Greek Key‖. Vùng III là đầu C của chuỗi polipeptid gồm 2 phiến gấp  song song nối với nhau bởi đoạn peptid vịng ngắn. Mỗi vùng có có vai trị quan trọng trong hoạt tính độc tố. Vùng I có vai trị chèn vào màng tế bào và hình thành lỗ hổng. Hai vùng II và III nhận biết các thụ thể đặc hiệu. Ngoài ra vùng III cũng tham gia vào tạo ra các lỗ hổng trên màng tế bào [37], [28].

Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với cơn trùng gồm 3 bƣớc chính [6], [24], [ 33], [35], [41].

Sau khi côn trùng ăn phải các tinh thể độc (tiền độc tố), các tinh thể độc đƣợc hòa tan ở ruột giữa cơn trùng do ở đây có pH kiềm (pH 10-12), tạo thành các chuỗi protein tiền độc tố có trọng lƣợng 130-135kDa, dƣới tác động của mơi trƣờng có pH>10 và sự hoạt động của enzym protease ở ruột giữa của ấu trùng phân giải tiền độc tố tạo ra protein dạng hoạt hố có kích thƣớc khoảng 55-75 kDa.

Độc tố sau khi đƣợc hoạt hoá gắn với các phân tử thụ thể đặc hiệu trên màng các tế bào biểu bì ruột giữa côn trùng.

Sau khi gắn kết, độc tố chèn vào màng tế bào và làm thay đổi gradient điện hoá do tạo ra các lỗ và các kênh chọn lọc và không chọn lọc. Điều này dẫn đến sự phá huỷ cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào, là nguyên nhân làm tế bào trƣơng và bị vỡ, làm cho cơn trùng khơng tiêu hố đƣợc thức ăn dẫn đến chết. Sự chết của cơn trùng diễn ra nhanh chóng, xác chết đã cung cấp dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của Bacillus thuringiensis từ những bào tử.

Hình 1.8. Mơ hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56]

1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen

Cũng nhƣ các cây lƣơng thực khác, các phƣơng pháp tạo cây khoai lang chuyển gen đã đƣợc tiến hành nghiên cứu từ những năm 1987. Đã có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cƣờng khả năng tái sinh cây khoai lang in vitro [51], [49], và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phƣơng pháp bắn gen [65]. Hay thông qua Agrobacterium để chuyển gen [83].

Song song với các nghiên cứu hệ thống tái sinh cây và chuyển gen là nghiên cứu phân lập các gen kháng côn trùng cry, vip, gen mã hoá lectin, gen dự trữ

protein ở củ, các gen tăng cƣờng hàm lƣợng axit amin cần thiết asp1, gen kháng virus SPMFV... và các promoter liên quan [82]. Gần đây, một số cơng trình nghiên cứu đã công bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích nhƣ gen

cry kháng cơn trùng; gen mã hố chất ức chế proteinase, kháng virus thông qua

hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium [58].

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hồn thiện qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bƣớc chuyển gen có giá trị sau này [6], [7], [13].

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu a. Thực vật: a. Thực vật:

Thực vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Giống khoai lang này đang đƣợc giữ tại phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

b. Chủng vi khuẩn:

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và Dƣợc học, Trƣờng Đại học Heidelberg, CHLB Đức)

- Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3

2.1.2. Hóa chất

Các mơi trường nuôi cấy:

- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: YMP - Môi trƣờng nuôi cấy thực vật MS

- Môi trƣờng đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM

Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine.

Các hóa chất thơng dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) thuộc phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs...

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vơ trùng, bình ni cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy ni lắc, máy đo pH. Kính hiển vi điện tử soi nổi (Olympus SZX ILLK 100, Japan)…

Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy hút chân không, máy đo OD, máy vortex .., cùng với các trang thiết bị khác của phịng Cơng nghệ tế bào thực vật và Phịng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium

2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium

Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glyxerol lên đĩa môi trƣờng YEP thạch có bổ sung spectinomycine 50 mg/L, ni ở 280

C trong 36-48 giờ. Sau đó lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong 5ml mơi trƣờng YEP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi ở nhiệt độ 280C, sau 8 giờ, chuyển tồn bộ 5ml dịch ni cấy trên sang 45ml mơi trƣờng YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine ni lắc 220 vịng/phút ở nhiệt độ 280C, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn ni cấy trên ly tâm với tốc độ 6000-6500 vịng/ phút, ở 40

C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hồ tan cặn với mơi trƣờng 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD600  0.5- 0.9. Dịch huyền phù vi khuẩn này có thể đƣợc sử dụng để biến nạp ngay hay có thể giữ ở 40

C trong 1-2 giờ.

2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá

Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 1cm2. Những mảnh lá, cuống lá và các chồi này sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phịng sau đó đƣợc đặt lên mơi trƣờng WPM nuôi trong tối 48 giờ, ở nhiệt độ 260

C

 20

C.

Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng các mảnh lá đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc.

2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.

Thƣờng sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào [11], [20]. Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4- Cl-3indolyl vẫn cịn là một chất dễ tan, khơng màu. Nhƣng ngay sau đó sản phẩm này bị ơxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ khơng tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng khơng có gus [3].

Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen đƣợc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm đƣợc tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trƣng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.

Nhuộm gus đƣợc thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm gus cũng để khẳng định gen chuyển đƣợc di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phơi của hạt hình thành từ cây chyển gen.

2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số

Các mảnh lá, cuống lá, chồi đƣợc nuôi trên môi trƣờng chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các dịng rễ trắng, đầu rễ khơng bị thâm đen, sinh trƣởng tốt để chuyển sang nuôi cấy lỏng trên mơi trƣờng WPM lỏng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime, rễ đƣợc ni lắc 80 vịng/phút ở nhiệt độ 260

C. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số.

Các mẫu sinh khối rễ đƣợc tách và tinh sạch DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và Jarret (1991).

2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Từ đó đến nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong cơng nghệ sinh học và đã góp phần to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung, của các nucleotid tự do với DNA khn, và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần.

Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và chu kỳ nhiệt trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồi của cặp mồi đã đƣợc thiết kế.

Trình tự các cặp mồi cry3 và virC đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes

cry3_F 5‘-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3‘ cry3_R 5‘-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3‘ virC_F 5'-ATCATTTGTAGCGACT-3' virC_R 5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3' Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc deion khử trùng 12,5 2 Buffer 10x 2,5 3 dNTPs 2,0 4 DNA 5,0 5 Taq polymerase 1,0 6 Primer F 1,0 7 Primer R 1,0 Tổng 25

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Số chu kỳ

1 Biến tính 95 180 1

2 Biến tính 93 30

35

3 Gắn mồi 52 30

4 Kéo dài chuỗi 72 70

5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên máy soi gel quả trên máy soi gel

Phƣơng pháp điện di trên gel agrose đƣợc sử dụng để kiểm tra kết quả DNA tổng số, kiểm tra các phân đoạn DNA đƣợc nhân bằng kĩ thuật PCR…

Agarose 0,8% đƣợc đun sôi, tiếp đến đƣợc hạ nhiệt độ xuống 500

– 600C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đơng cứng, tiến hành tháo lƣợc, đặt khay gel vào bể điện di. Bổ xung đệm TAE 1X vào bể sao cho gel ngập trong đệm khoảng 2mm.

Tra mẫu: Mẫu DNA đƣợc mix cùng với dye 6x, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.

Tiến hành điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100-130V, cƣờng độ dòng điện 60 – 80mA, đến khi vệt màu của bromophenol blue cách mép bản gel 1-2cm thì kết thúc điện di.

Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10g/ml) trong thời gian 20 phút.

Quan sát và chụp ảnh: Gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp trên máy Bio –