Đồng nuôi
cấy (ngày) Tổng số mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 2 100x3 20 20 21 20,33+0,33 20,33+0,33 3 100x3 19 20 23 20,67+4,33 20,67+4,33 4 100x3 20 21 21 20,67+0,33 20,67+0,33
Qua bảng trên cho thấy khi thời gian đồng nuôi cấy tăng từ 2 đến 4 tỷ lệ các mẫu dƣơng tính khi nhuộm gus khác nhau khơng nhiều (từ 20,33% và 20,67%). Kết quả sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α = 0,05) khi thay đổi thời gian đồng ni cấy 2; 3 và 4 ngày trong thí nghiệm.
Theo Wahlroos &CS (2003), thời gian đồng nuôi cấy phụ thuộc vào từng loại thực vật. Nhƣ trên táo Malus zumi (Matsumura) Rehd là 3 ngày [44]. R. Pratap Chandran và cộng sự (2011) lại tiến hành đồng nuôi cấy 2 ngày đối với khoai lang, khoai tây. Simon Deroles &CS (2002) cũng tiến hành đồng nuôi cấy 2 ngày trên cà rốt [72]. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày cho các thí nghiệm tiếp theo. Với thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày tránh đƣợc sự phát triển trở lại của vi khuẩn có hại cho tế bào thực vật nhƣ gây hoại tử, mô không bị thấm ƣớt sẽ thuận lợi cho cấy chuyển. [76].
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp
Mật độ tế bào vi khuẩn có ảnh hƣởng đến hiệu quả trong biến nạp. Nếu mật độ tế bào vi khuẩn thấp khả năng tiếp xúc vi khuẩn với tế bào thực vật bị hạn chế.
Ngƣợc lại nếu mật độ q cao khi ni cấy có sự cạnh tranh dinh dƣỡng giữa các tế bào, thời gian nuôi cấy dài làm vi khuẩn nhanh bị già làm giảm hiệu quả trong biến nạp. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành xác định mật độ tế bào vi khuẩn thích hợp để sử dụng cho q trình biến nạp vào khoai lang thơng qua vi khuẩn A. rhizogens. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau.
Các mảnh lá đƣợc làm tổn thƣơng và ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đƣợc pha lỗng từ 0,5 đến 0,9 ở nhiệt độ phịng trong thời gian 20 phút. Kết thúc thời gian lây nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mẫu đƣợc nhuộm với X-Gluc ở 370C trong 8-12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn 70% (v/v) để xác định biểu hiện của gen gus. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong bảng sau.