STT Digoxin (g) Digitoxin (g) Tá dược (g) 1 0,0040 0,0037 2,9812 2 0,0035 0,0040 3,0204 3 0,0045 0,0049 3,1102 4 0,0032 0,0030 2,9942 5 0,0043 0,0060 2,9918 6 0,0000 0,0042 2,9967 7 0,0040 0,0037 2,9812 8 0,0035 0,0040 3,0204 9 0,0045 0,0049 3,1102 10 0,0030 0,0030 2,9941
Lưu lại kết quả dưới dạng ma trận tín hiệu đo kiểm tra (10x106) và chuyển dữ liệu vào phần mềm Matlb để tính kết quả.
Bước 1: Tìm số cấu tử chính theo PCA trên phần mềm Minitab
Nhập số liệu vào chương trình MINITAB 15, trong đó biến ở các cột là các pic (gồm 106 pic của 30 chất) từ 1 đến 30. Các hàng là mẫu phân tích (gồm 30 mẫu).
Trong cửa sổ chương trình, bật Stat-> Multivariate-> principal components, nhập biến là các cột chứa dữ liệu độ hấp thụ quang của 30 chất, số thành phần chính về lý thuyết có thể chọn là 30. Ma trận được dùng có thể là ma trận tương quan (nếu các biến ko cùng thứ nguyên) hoặc ma trận đồng phương sai. Phần đồ thị gồm scree plot và score plot với hai thành phần chính được dùng để mơ tả .
Kết quả trị riêng của ma trận hệ số tương quan của các PC thu được như sau: Trị riêng 103,27 3,46 0,18 0,07 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Phương sai đóng góp 0,965 0,032 0,002 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Phương sai tính riêng 0,965 0,998 0,999 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Trị riêng 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Phương sai đóng góp 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Phương sai tính riêng 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
Kết quả tính được ở các PC cho thấy sự kết hợp tuyến tính của các biến ban đầu giải thích cho phương sai trong tập số liệu.
Đồ thị screeplot (đồ thị biểu diễn giá trị riêng theo số thành phần) cho thấy 3 PC đầu tiên có giá trị riêng lớn nhất (phương sai tích luỹ chiếm tới 99,9 tổng số phương sai của 106 yếu tố. Nếu tính 4 PC thì giá trị phương sai tích luỹ đạt tới 100 %, riêng PC đầu tiên đã có giá trị 96,5%. Vì vậy có thể bỏ qua ảnh hưởng của các PC khác từ PC 5 đến PC 106, có thể chọn các PC 1,2,3 và 4.
Bước 2 : Nhập ma trận khối lượng (30x3), ma trận kiểm tra (10x3), ma trận tín hiệu đo (30x106), ma trận tín hiệu kiểm tra (10x106) vào phần mềm Matlab tính tốn theo PCR với số cấu tử chính tìm được ở Bước 1 lần lượt là 1,2,3 và 4
Khối lượng digoxin và digitoxin trong 10 mẫu kiểm tra và độ lệch chuẩn của phép đo với các PC được chọn là 1,2, 3 và 4 được trình bày ở bảng từ 3.15
Bảng 3.15 Độ lệch chuẩn tương đối của mơ hình hồi quy tuyến tính đa biến xác định đồng thời digoxin và digitoxin với số cấu tử từ 1-4
Số cấu tử Số mẫu 1 (RSD%) 2(RSD%) 3(RSD%) 4(RSD%) Digoxin Digitoxin Digoxin Digitoxin Digoxin Digitoxin Digoxin Digitoxin 1 15,9 -40,3 12,7 -15,3 15,2 -8,1 14,6 -10,6 2 45,0 -42,0 -8,4 -16,2 7,6 21,2 7,4 20,4 3 22,1 -25,5 15,1 2,0 30,0 38,3 28,2 32,4 4 4,5 -13,9 8,9 -10,2 -14,1 -75,8 -14,6 -77,9 5 36,9 -9,8 10,5 17,5 6,8 10,5 5,5 7,0 6 0,0 -40,9 0,0 -5,1 0,0 -50,1 0,0 -49,0 7 15,9 -40,3 12,7 -15,3 15,2 -8,1 14,6 -10,6 8 45,0 -42,0 -8,4 -16,2 7,6 21,2 7,4 20,4 9 -22,2 -25,5 15,1 2,0 30,0 38,3 28,2 32,4 10 8,5 -2,3 1,3 -8,1 -9,3 -36,5 -8,0 -31,7
Từ kết quả thu được ở trên chúng tôi nhận thấy khi lựa chọn số cấu tử khác nhau sai số tương đối của phép đo sẽ khác nhau. Cụ thể, khi cấu tử là 1 sai số trong khoảng 2-45%, cấu tử là 2 sai số trong khoảng 1,3 – 17%, cấu tử là 3 sai số trong khoảng 6,8 – 75,8%, cấu tử là 4 sai số trong khoảng 5,5 – 32%. Như vậy, với số cấu tử là 2, cho sai số thấp nhất. Chúng tôi lựa chọn số cấu tử là 2 trong mơ hình hồi quy tuyến tính.
Kết luận: phương pháp hồi quy đa biến sử dụng mơ hình hồi quy cấu tử chính cho kết quả tương đối tốt. Khối lượng digoxin và digitoxin tính được sai khác
khơng đáng kể so với khối lượng thực trong mẫu kiểm tra (sai số tương đối tính theo phương pháp này đều thuộc khoảng sai số cho phép). Do đó hồn tồn có thể áp dụng phương pháp này để xác định đồng thời các hoạt chất trên trong cùng một hỗn hợp mà không cần phải tách loại.
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)
Theo IUPAC và ISO, LOD được xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được. Như vậy, LOD phụ thuộc và thành phần nền của mẫu phân tích.
Nếu tính giới hạn phát hiện dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) thì LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3
LOQ được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
yQ = + k. SB
Thơng thường LOQ được tính với K = 10 tức là CQ = 10. SB/b
Tiến hành đo lặp lại 10 lần độ hấp thụ quang 1 đường nền của mẫu phân tích, ta được ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang của đường nền (10x106), nhập dữ liệu vào phần mềm Minitab 15 tính độ lệch chuẩn, ta được ma trận Z (1x106), nhập ma trận Z vào Matlab để tính LOD, LOQ của phương pháp theo cơng thức:
LOD = (3*Z)x Fj LOQ = (10*Z)x Fj
Bảng 3.16 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng thời digoxin và digitoxin
Tên LOD µg/viên nén LOQ µg/viên nén Digoxin 9,68 35,63 Digitoxin 12,13 50,43
3.3.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
Hiệu suất thu hồi của phương pháp là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp, cho biết độ tin cậy của phương pháp xử lý mẫu đã chọn.
Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành chuẩn bị ba mẫu, quy trình thực hiện theo 2.3.1
Mẫu 1 : 1 viên thuốc viên digoxin D2 0,1001 g nghiền nhỏ
Mẫu 2 : 1 viên thuốc viên digoxin D2 0,1001 g trộn thêm 0,002g digoxin và 0,002g digitoxin
Mẫu 3 : 1 viên thuốc viên digoxin D2 0,1001 g nghiền nhỏ trộn thêm 0,003g digoxin và 0,001g digitoxin
Sau đó đem ba mẫu trên đo phổ hấp thụ hồng ngoại, chúng tơi thu được ma trận tín hiệu đo (3x106), nhập ma trận đo này vào mơ hình hồi quy tuyến tính đã được xây dựng ở 3.3.1, mỗi mẫu tiến hành 3 lần rồi lấy giá trị trung bình, giá trị trung bình hàm lượng digoxin và digitoxin trong ba mẫu thêm chuẩn được trình bày ở bảng 3.17
Bảng 3.17: Hàm lượng digoxin và digitoxin trong mẫu thêm chuẩn xác định theo mơ hình hồi quy đa biến tuyến tính.
Mẫu Digoxin Digitoxin
Tổng hoạt chất (10-4) (g) Hàm lượng thêm vào (10-4) (g) Hàm lượng tìm thấy (10-4) (g) Độ thu hồi (%) Hàm lượng thêm vào (10-4) (g) Hàm lượng tìm thấy (10-4) (g) Độ thu hồi (%) 1 0 1,066 - 0 1,433 - 2,5 2 20 11,26 0,51 20 12,67 0,56 42,5 3 30 19,66 0,62 10 21,83 2,04 42,5
Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy, kết quả xác định hàm lượng hoạt chất sai khác so với hàm lượng hoạt chất thêm vào, độ thu hồi thấp, nhưng kết quả tổng hàm lượng digoxin và digitoxin lại bằng tổng hàm lượng thực tế của hai chất trên. Do vậy, không thể xác định đồng thời digoxin và digitoxin bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thống kê đa biến.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Với mục tiêu ban đầu nhóm nghiên cứu chúng tơi đặt ra cho luận văn là: nghiên cứu, xây dựng quy trình xác định hàm lượng digoxin và digitoxin trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến, sau khi nghiên cứu chúng tôi đạt được những kết quả sau:
- Điều kiện tối ưu xác định hoạt chất digoxin và digitoxin bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại: vùng số sóng tối ưu 3000-2800 cm-1, Tỉ lệ trộn mẫu: KBr là 3/97, khối lượng mẫu ép viên: 25mg, số lần ép viên: 15 lần, khối lượng mẫu chuẩn, số PC của mơ hình.
- Các tá dược đều ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của các hoạt chất trong vùng số sóng 3000-2800cm-1, ba tá dược lactoza, magiestearat đều hấp thụ mạnh trong vùng này, còn bột talc hấp thụ yếu hơn. Do đó, khơng thể xác định hàm lượng các hoạt chất trong mẫu dược phẩm mà không sử dụng phương pháp thống kê đa biến.
- Xây dựng được mơ hình hồi quy tuyến tính xác định riêng digoxin trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến PCR.. Áp dụng phương pháp này với 2 cấu tử chính để phân tích các mẫu kiểm chứng cho kết quả: từ 0,7 – 16% (đều nằm trong ngưỡng cho phép) với LOD (13,2µm/viên), LOQ (21,00µm/viên). Vì thế phương pháp này được lựa chọn để xác định các hoạt chất trong mẫu cần nghiên cứu.
- Xác định được hàm lượng digoxin trong hai mẫu dược phẩm đang lưu thông trên thị trường. Kết luận D1 sai khác trên bao bì 4,25 %, D2 là 0,69%. So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sai khác giữa hai phương pháp là có thể chấp nhận được.
Kết quả thu được từ hướng nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các hoạt chất trong mẫu đo phức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép phân tích ra hiện trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Việt Anh, Nguyễn Hoàng Hải (2009), Lập trình Matlab và ứng dụng,
Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam, Xuất bản lần thứ 4, NXB Y học, Hà Nội. 3. Bộ Y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, Xuất bản lần thứ 4, NXB Y học,
Hà Nội.
4. Nguyễn Văn Đông (2006), Nghiên cứu phương pháp hồi quy đa biến xác định đồng thời một số kim loại trong hỗn hợp, Luận văn thạc sĩ Hóa học, Đại học
Quốc gia Hà Nội.
5. Kiều Thu Hà (2009), Nghiên cứu phương pháp động học – trắc quang kết hợp
với thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp, Luận văn thạc sĩ Hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Đoàn Thị Hưng (2007) Phương pháp trắc quang xác định đồng thời Fe và Ti
trong xi măng và cốt liệu xi măng, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Quốc gia Hà
Nội.
7. Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007) Nghiên cứu tách và xác định đồng thời một số
sulfamit trong thức ăn chăn nuôi và thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận văn thạc sĩ Hóa học, Đại học quốc gia Hà Nội.
9. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
10. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng thống kê trong hóa phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
12. GS.TSKH. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong
hóa, Trường Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
13. Jedlicka, T. Grafnetterova´, V. Miller, (2003), "HPLC method with UV detection for evaluation of digoxin tablet dissolution in acidic medium after solid-phase extraction", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
,pp.109 – 115.
14. Jouan-Rimbaud Bouveresse, A. Moya-González, F. Ammari, D.N. Rutledge, (2012), "Two novel methods for the determination of the number of components in independent components analysis models", Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 9.
15. Di Wu, Jianyang Chen, Baiyi Lu, Lina Xiong, Yong He, Ying Zhang, (2012), "Application of near infrared spectroscopy for the rapid determination of antioxidant activity of bamboo leaf extract", Food Chemistry,135, pp. 2147–
2156.
16. E. Jungman, C. Laugel, D.N. Rutledge, P. Dumas, A. Baillet-Guffroy, (2013), "Development of a percutaneous penetration predictive model by SR-FTIR." ,International Journal of Pharmaceutics, 441, pp.628-635.
17. Emil W.Ciurczak, James K.Drenen, (2013), Pharmaceutical and Medical Applications of Near- Infrared Spectroscopy.
18. Faten Ammari, Christophe B.Y. Cordella, Néziha Boughanmi , Douglas N. Rutledge, (2011), "Independent components analysis applied to 3D-front-face fluorescence spectra of edible oils to study the antioxidant effect of Nigella sativa L. extract on the thermal stability of heated oils", Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 11.
19. Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti, (2009), "Optimization and validation of a high-
performance liquid chromatography method for the", Journal of Chromatography, pp.3260–3269.
20. Julien Boccard, Douglas N. Rutledge, (2013), "A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) strategy for multiblock Omics data fusion", Analytica Chimica Acta, 769, pp.30-39.
21. L.K. Hearn *, P.P. Subedi .(2009), "Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy."
Journal of Food Composition and Analysis,22,pp.165–168.
22. Mafalda Cruz Sarraguc¸ a, Sandra Oliveira Soares, João Almeida Lopes, (2009), "A near-infrared spectroscopy method to determine aminoglycosides in pharmaceutical formulations”, Analytica Chimica Acta, 469, pp.40-49.
23. P Sohch, VSedhakovos and R KarliiFek. (1992), "Spectrophotometric determination of cardiac glycosides by flow-injection analysis", Analytrca Chumca Acta, 269, pp.199-203.
24. Payal Roychoudhury, Brian McNeil, Linda M. Harvey, (2007), "Simultaneous determination of glycerol and clavulanic acid in an antibiotic bioprocess using attenuated total reflectance mid infrared spectroscopy", Analytica Chimica Acta, 585, pp.246–252.
25. S.T.H. Sherazi, M. Ali, S.A. Mahesar, (2011), "Application of Fourier- transform infrared (FT-IR) transmission spectroscopy for the estimation of roxithromycin in pharmaceutical formulations", Vibrational Spectroscopy, 55, pp.115–118.
26. Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki, (1989), "High – performance liquid choramatography determination of secondary cardiac glycosides in digitalis purpurea leaves." Journal of Chromatography
27. Yves Roggo∗, Pascal Chalus, Lene Maurer, Carmen Lema-Martinez, Aur´elie Edmond, Nadine Jent F.Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland (2007), "A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis , pp.683–
PHỤ LỤC Phụ lục 1 Ma trận tín hiệu đo khảo sát nền
Mẫu/ số sóng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2798 0.3356 0.3361 0.3374 0.3399 0.3360 0.3388 0.3360 0.3379 0.3372 0.3387 2800 0.3377 0.3404 0.3393 0.3417 0.3398 0.3416 0.3384 0.3405 0.3399 0.3407 2802 0.3406 0.3434 0.3403 0.3435 0.3430 0.3433 0.3412 0.3422 0.3426 0.3432 2804 0.3439 0.3444 0.3416 0.3453 0.3442 0.3448 0.3434 0.3435 0.3451 0.3454 2806 0.3452 0.3443 0.3436 0.3457 0.3440 0.3462 0.3444 0.3446 0.3466 0.3463 2808 0.3445 0.3439 0.3452 0.3448 0.3440 0.3465 0.3451 0.3449 0.3468 0.3463 2810 0.3437 0.3437 0.3456 0.3441 0.3454 0.3453 0.3460 0.3445 0.3463 0.3459 2812 0.3434 0.3442 0.3452 0.3444 0.3465 0.3435 0.3467 0.3447 0.3458 0.3453 2814 0.3425 0.3451 0.3445 0.3450 0.3458 0.3424 0.3468 0.3456 0.3456 0.3445 2816 0.3421 0.3463 0.3444 0.3461 0.3446 0.3428 0.3470 0.3465 0.3467 0.3443 2817 0.3444 0.3484 0.3458 0.3490 0.3457 0.3453 0.3489 0.3476 0.3493 0.3461 2819 0.3496 0.3523 0.3496 0.3539 0.3500 0.3500 0.3529 0.3507 0.3525 0.3506 2821 0.3562 0.3580 0.3550 0.3595 0.3562 0.3563 0.3584 0.3565 0.3564 0.3566 2823 0.3626 0.3642 0.3610 0.3652 0.3628 0.3626 0.3641 0.3636 0.3614 0.3632 2825 0.3678 0.3696 0.3669 0.3705 0.3689 0.3678 0.3693 0.3698 0.3668 0.3693 2827 0.3717 0.3736 0.3726 0.3748 0.3738 0.3716 0.3738 0.3736 0.3720 0.3738 2829 0.3747 0.3767 0.3774 0.3779 0.3772 0.3746 0.3774 0.3761 0.3765 0.3767 2831 0.3777 0.3794 0.3806 0.3801 0.3795 0.3778 0.3800 0.3784 0.3798 0.3792 2833 0.3808 0.3823 0.3828 0.3825 0.3815 0.3819 0.3821 0.3808 0.3825 0.3825 2835 0.3847 0.3857 0.3850 0.3854 0.3843 0.3860 0.3848 0.3836 0.3855 0.3866 2837 0.3899 0.3901 0.3887 0.3895 0.3888 0.3897 0.3889 0.3880 0.3896 0.3914 2839 0.3963 0.3959 0.3950 0.3956 0.3954 0.3947 0.3954 0.3953 0.3953 0.3973 2841 0.4047 0.4044 0.4049 0.4046 0.4048 0.4042 0.4051 0.4059 0.4039 0.4065 2843 0.4170 0.4180 0.4189 0.4179 0.4183 0.4190 0.4189 0.4202 0.4174 0.4199 2844 0.4353 0.4377 0.4380 0.4365 0.4372 0.4384 0.4375 0.4391 0.4369 0.4382 2846 0.4587 0.4610 0.4614 0.4593 0.4602 0.4610 0.4602 0.4619 0.4603 0.4603 2848 0.4807 0.4814 0.4821 0.4802 0.4810 0.4814 0.4817 0.4828 0.4810 0.4807 2850 0.4912 0.4906 0.4906 0.4901 0.4909 0.4900 0.4925 0.4923 0.4904 0.4909 2852 0.4860 0.4849 0.4842 0.4855 0.4863 0.4833 0.4873 0.4860 0.4857 0.4869 2854 0.4714 0.4703 0.4698 0.4721 0.4723 0.4683 0.4722 0.4697 0.4725 0.4736 2856 0.4566 0.4564 0.4559 0.4578 0.4569 0.4543 0.4570 0.4538 0.4584 0.4589 2858 0.4467 0.4475 0.4465 0.4479 0.4463 0.4457 0.4470 0.4444 0.4483 0.4484 2860 0.4431 0.4431 0.4423 0.4443 0.4425 0.4427 0.4428 0.4421 0.4435 0.4437