TT Tên Enzyme (n=4) Protease Alpha- amylase Lipase Không sử dụng enzyme Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD 1 Acebutolol 99,4 9,2 104,0 8,2 90,5 9,5 98,2 5,8 2 Alprenolol 100,1 8,3 103,2 4,1 102,3 4,4 97,6 4,6 3 Atenolol 91,4 12,5 80,6 11,5 112,1 5,8 103,3 12,1 4 Betaxolol 98,2 6,2 105,4 5,4 84,7 4,3 99,4 6,5 5 Celiprolol 98,6 4,1 100,0 8,5 94,6 5,2 102,2 6,7 6 Esmolol 98,2 5,3 101,3 6,4 87,3 2,7 111,5 7,4 7 Labetolol 98,8 5,8 103,2 10,3 86,2 5,1 109,5 8,0 8 Levobunolol 98,5 2,4 101,6 13,6 84,0 5,3 98,8 4,3 9 Metoprolol 100,0 2,3 103,4 13,2 85,7 8,2 95,4 9,6 10 Propranolol 99,3 6,2 94,7 8,0 101,4 12,4 95,2 8,2 Min 91,4 2,3 80,6 4,1 84,0 2,7 95,2 4,3 Max 100,1 12,5 105,4 13,6 112,1 12,4 111,5 12,1
Kết quả cho thấy với các mẫu sử dụng enzyme: enzyme protease độ thu hồi của nhóm chẹn beta dao động từ 91,4 đến 100,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,3 đến 12,5%. Với enzyme alpha-amylase độ thu hồi dao động từ 80,6 đến 105,4% với độ lệch chuẩn tương đối từ 4,1 đến 13,6%. Đối với enzyme lipase độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động từ 84,0 đến 112,1% với độ lệch chuẩn
tương đối từ 2,7 đến 12,4%. Với mẫu không sử dụng enzyme, độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động từ 95,2 đến 111,5% với độ lệch chuẩn tương đối từ 4,3 đến 12,1%. Qua các kết quả thu được ta thấy, việc thuỷ phân mẫu bằng enzyme và khơng sử dụng enzyme khơng có sự khác biệt nhiều, việc enzyme hóa có tác động khơng đáng kể tới q trình xác định các nhóm chẹn beta. Do đó, bước thủy phân bằng enzyme có thể lược bỏ trong q trình chiết mẫu.
3.2.3. Lựa chọn dung mơi chiết
Q trình khảo sát dung mơi chiết được tiến hành như sau: Mẫu nước tiểu lưu giữ trong tủ lạnh được rã đông ở 37oC và được ly tâm trong 5 phút (2500 rpm), hỗn hợp dung dịch chuẩn và nội chuẩn được thêm vào để nồng độ cuối cùng đạt 200 ppb.
Mẫu nước tiểu được chuẩn bị chiết bằng việc sử dụng kỹ thụât chiết pha rắn phân tán với các dung môi: Acetone, Acetonitril, Ethyl acetate và Methanol. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta để xem xét quá trình chiết mẫu bằng các loại dung mơi khác nhau có ảnh hưởng tới việc xác định các chất nhóm chẹn beta hay khơng. Kết quả về độ thu hồi và độ lệch chuẩn của các chất nhóm chẹn beta với các dung mơi chiết khác nhau được thể hiện trong bảng 14 sau:
Bảng 14. Độ thu hồi, độ lệch chuẩn của các chất nhóm chẹn beta theo các dung mơi chiết khác nhau
Tên Acetone Acetonitril EtAc MeOH
Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Acebutolol 74,5 19,2 86,2 12,4 105,1 10,1 59,3 9,2 Alprenolol 77,1 18,5 92,4 7,5 84,3 5,4 50,2 11,3 Atenolol 60,2 12,4 105,2 8,4 71,4 14,3 43,4 12,5 Betaxolol 54,7 16,0 96,5 8,2 94,6 12,5 54,5 10,1 Celiprolol 42,5 14,1 100,3 7,3 95,2 10,6 43,2 8,4 Esmolol 60,4 15,4 105,1 7,6 92,6 8,4 41,5 10,6
Tên Acetone Acetonitril EtAc MeOH
Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Levobunolol 65,8 12,4 103,5 6,7 87,4 6,6 60,1 16,5 Metoprolol 66,3 14,7 105,4 7,5 60,3 17,3 38,5 21,3 Propranolol 56,7 16,3 78,7 8,4 87,2 8,2 53,4 8,4 Rec: % Độ thu hồi; RSD: % Độ lệch chuẩn tương đối.
Kết quả khảo sát dung môi chiết cho thấy, đối với dung môi chiết là Acetone, độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 42,5 đến 79,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 12,4 đến 19,2%.
Đối với dung môi Acetonitril, độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 78,7 đến 105,2% với độ lệch chuẩn tương đối từ 6,7 đến 12,4%.
Đối với Ethyl Acetate: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 60,3 đến 105,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 5,4 đến 17,3%.
Đối với MeOH: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 38,5 đến 60,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 8,4 đến 21,3%.
Dựa vào độ thu hồi của các chất trong nhóm chẹn beta, chúng tơi lựa chọn dung môi Acetonitril là dung môi chiết cho nghiên cứu này. Do dung mơi Acetonitril là dung mơi ít tan trong nước, có độ quay cực là 3,84 D (độ phân cực trung bình) nên Acetonitril có khả năng hịa tan tốt các chất khơng phân cực và ion. Trong lĩnh vực hóa học, Acetonitril là một trong các dung mơi hữu cơ được dung nhiều trong công tác tách chiết cũng như được sử dụng làm pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.
3.2.4. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình chiết tách
Quá trình tiến hành như sau: Mẫu nước tiểu lưu giữ trong tử lạnh được rã đông ở 37 oC và được ly tâm trong 5 phút (2500 rpm), hỗn hợp dung dịch chuẩn và nội chuẩn được thêm vào để nồng độ cuối cùng đạt 200 ppb. Mẫu nước tiểu được ổn định tại các điểm pH khác nhau: 5, 6, 7 và 8.
Mẫu nước tiểu được chuẩn bị chiết bằng việc sử dụng kỹ thụât chiết phân tán với dung môi Acetonitril. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của
các chất nhóm chẹn beta để xem xét ảnh hưởng của pH tới việc xác định các chất nhóm chẹn beta . Kết quả thu được trong bảng 15 như sau: