tín hiệu của nhóm chẹn beta dao động từ 0,7 đến 1,8%. Điều này cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng khơng đáng kể tới cường độ tín hiệu của các chất trong nhóm chẹn beta. Tương tự với thời gian lưu, có thể nhận thấy, thời gian lưu của các chất trong nhóm chẹn beta gần như khơng có thay đổi lớn khi nhiệt độ thay đổi (% độ lệch chuẩn tương đối chỉ dao động từ 0,5 đến 1,1).
Tóm lại: Có thể nhận thấy với nhiệt độ cột dao động từ 10-50o C thì khơng có ảnh hưởng đáng kể tới thời gian lưu (độ phân giải) của các chất nhóm chẹn beta. Do vậy, trên cơ sở các thực nghiệm sau, vấn đề nhiệt độ không cần thiết phải cân nhắc mà nhiệt độ của cột có thể để tự nhiên theo nhiệt độ phịng mà khơng cần
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của quá trình chuẩn bị mẫu 3.2.1. Dự kiến các bƣớc tiến hành chuẩn bị mẫu 3.2.1. Dự kiến các bƣớc tiến hành chuẩn bị mẫu
Quy trình dự kiến các bước sử dụng để phân tích nhóm chẹn beta trong nước tiểu như sau:
Lấy mẫu: Mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên khỏe mạnh.
Thủy phân bằng enzyme: Bổ sung 1 ml đệm phốt phát (0,2 M, pH 7) và 70 µl
enzyme (140 U/ml) và tiến hành thuỷ phân ở 50 oC trong 70 phút
Chiết mẫu: 10 ml mẫu được chuyển vào ống ly tâm Teflon dung tích 50 ml,
thêm hỗn hợp nội chuẩn và 10 ml dung môi acetonitrile vào ống ly tâm và lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer. Sau đó, ống ly tâm chứa mẫu được đặt vào trong tủ lạnh khoảng 30 phút rồi lấy ra, thêm 4 gam MgSO4 và 1 gam NaCl vào ống ly tâm và tiếp tục lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer. Ly tâm hỗn hợp này bằng hệ thống ly tâm lạnh ở 4 oC, tốc độ ly tâm là 3500 vòng/phút. Lấy 2 ml dung dịch ở phía trên trong ống ly tâm và chuyển vào ống ly tâm nhỏ có thể tích 5 ml.
Làm sạch mẫu: Sau khi lấy 2 ml dung dịch ở phía trên trong ống ly tâm và
chuyển vào ống ly tâm nhỏ có thể tích 5 ml. Trong ống ly tâm nhỏ này có để sẵn 50 mg PSA và 300 mg MgSO4. Lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer, sau đó ly tâm hỗn hợp này bằng hệ thống ly tâm lạnh ở 4 oC, tốc độ ly tâm là 3500 vịng/phút. Lấy 1,0 ml, dung dịch ở phía trên chuyển sang vial 1,2 ml để phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS).
3.2.2. Ảnh hƣởng của quá trình thủy phân bằng enzyme
Quá trình thủy phân bằng enzyme là quá trình sử dụng enzyme để phân tách các phân tử có cấu trúc cồng kềnh khỏi nền mẫu để loại bỏ các chất có thể gây ảnh hưởng tới q trình phân tích mà khơng làm mất chất phân tích. Trong thực nghiệm này, quá trình thuỷ phân bằng enzyme nhằm mục đích loại bỏ các protein, các chất đường, tinh bột và chất béo có trong nền mẫu nước tiểu.
nồng độ cuối cùng đạt 200 ppb. Mẫu được thêm 1 ml đệm phốt phát (0,2 M, pH 7) và 70 µl enzyme (140 U/ml) và tiến hành thuỷ phân ở 50 oC trong 70 phút. Sau quá trình thuỷ phân, sử dụng kỹ thụât chiết phân tán để chiết mẫu bằng dung môi Acetonitril. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của nhóm chẹn beta để xem xét q trình thuỷ phân có ảnh hưởng tới việc xác định các chất trong nhóm này khơng.
Quá trình thủy phân được thực hiện với 03 mẫu sử dụng 03 loại enzyme bao gồm: enzyme protease, enzyme alpha-amylase, enzyme lipase và 01 mẫu không sử dụng enzyme. Kết quả độ thu hồi thu được như sau:
Bảng 13: Độ thu hồi khi sử dụng các enzyme trong quá trình thuỷ phân
TT Tên Enzyme (n=4) Protease Alpha- amylase Lipase Không sử dụng enzyme Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD 1 Acebutolol 99,4 9,2 104,0 8,2 90,5 9,5 98,2 5,8 2 Alprenolol 100,1 8,3 103,2 4,1 102,3 4,4 97,6 4,6 3 Atenolol 91,4 12,5 80,6 11,5 112,1 5,8 103,3 12,1 4 Betaxolol 98,2 6,2 105,4 5,4 84,7 4,3 99,4 6,5 5 Celiprolol 98,6 4,1 100,0 8,5 94,6 5,2 102,2 6,7 6 Esmolol 98,2 5,3 101,3 6,4 87,3 2,7 111,5 7,4 7 Labetolol 98,8 5,8 103,2 10,3 86,2 5,1 109,5 8,0 8 Levobunolol 98,5 2,4 101,6 13,6 84,0 5,3 98,8 4,3 9 Metoprolol 100,0 2,3 103,4 13,2 85,7 8,2 95,4 9,6 10 Propranolol 99,3 6,2 94,7 8,0 101,4 12,4 95,2 8,2 Min 91,4 2,3 80,6 4,1 84,0 2,7 95,2 4,3 Max 100,1 12,5 105,4 13,6 112,1 12,4 111,5 12,1
Kết quả cho thấy với các mẫu sử dụng enzyme: enzyme protease độ thu hồi của nhóm chẹn beta dao động từ 91,4 đến 100,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,3 đến 12,5%. Với enzyme alpha-amylase độ thu hồi dao động từ 80,6 đến 105,4% với độ lệch chuẩn tương đối từ 4,1 đến 13,6%. Đối với enzyme lipase độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động từ 84,0 đến 112,1% với độ lệch chuẩn
tương đối từ 2,7 đến 12,4%. Với mẫu không sử dụng enzyme, độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động từ 95,2 đến 111,5% với độ lệch chuẩn tương đối từ 4,3 đến 12,1%. Qua các kết quả thu được ta thấy, việc thuỷ phân mẫu bằng enzyme và khơng sử dụng enzyme khơng có sự khác biệt nhiều, việc enzyme hóa có tác động khơng đáng kể tới q trình xác định các nhóm chẹn beta. Do đó, bước thủy phân bằng enzyme có thể lược bỏ trong q trình chiết mẫu.
3.2.3. Lựa chọn dung mơi chiết
Q trình khảo sát dung mơi chiết được tiến hành như sau: Mẫu nước tiểu lưu giữ trong tủ lạnh được rã đông ở 37oC và được ly tâm trong 5 phút (2500 rpm), hỗn hợp dung dịch chuẩn và nội chuẩn được thêm vào để nồng độ cuối cùng đạt 200 ppb.
Mẫu nước tiểu được chuẩn bị chiết bằng việc sử dụng kỹ thụât chiết pha rắn phân tán với các dung môi: Acetone, Acetonitril, Ethyl acetate và Methanol. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta để xem xét q trình chiết mẫu bằng các loại dung mơi khác nhau có ảnh hưởng tới việc xác định các chất nhóm chẹn beta hay khơng. Kết quả về độ thu hồi và độ lệch chuẩn của các chất nhóm chẹn beta với các dung mơi chiết khác nhau được thể hiện trong bảng 14 sau:
Bảng 14. Độ thu hồi, độ lệch chuẩn của các chất nhóm chẹn beta theo các dung mơi chiết khác nhau
Tên Acetone Acetonitril EtAc MeOH
Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Acebutolol 74,5 19,2 86,2 12,4 105,1 10,1 59,3 9,2 Alprenolol 77,1 18,5 92,4 7,5 84,3 5,4 50,2 11,3 Atenolol 60,2 12,4 105,2 8,4 71,4 14,3 43,4 12,5 Betaxolol 54,7 16,0 96,5 8,2 94,6 12,5 54,5 10,1 Celiprolol 42,5 14,1 100,3 7,3 95,2 10,6 43,2 8,4 Esmolol 60,4 15,4 105,1 7,6 92,6 8,4 41,5 10,6
Tên Acetone Acetonitril EtAc MeOH
Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Levobunolol 65,8 12,4 103,5 6,7 87,4 6,6 60,1 16,5 Metoprolol 66,3 14,7 105,4 7,5 60,3 17,3 38,5 21,3 Propranolol 56,7 16,3 78,7 8,4 87,2 8,2 53,4 8,4 Rec: % Độ thu hồi; RSD: % Độ lệch chuẩn tương đối.
Kết quả khảo sát dung môi chiết cho thấy, đối với dung môi chiết là Acetone, độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 42,5 đến 79,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 12,4 đến 19,2%.
Đối với dung mơi Acetonitril, độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 78,7 đến 105,2% với độ lệch chuẩn tương đối từ 6,7 đến 12,4%.
Đối với Ethyl Acetate: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 60,3 đến 105,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 5,4 đến 17,3%.
Đối với MeOH: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động từ 38,5 đến 60,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 8,4 đến 21,3%.
Dựa vào độ thu hồi của các chất trong nhóm chẹn beta, chúng tơi lựa chọn dung môi Acetonitril là dung môi chiết cho nghiên cứu này. Do dung môi Acetonitril là dung mơi ít tan trong nước, có độ quay cực là 3,84 D (độ phân cực trung bình) nên Acetonitril có khả năng hịa tan tốt các chất khơng phân cực và ion. Trong lĩnh vực hóa học, Acetonitril là một trong các dung mơi hữu cơ được dung nhiều trong công tác tách chiết cũng như được sử dụng làm pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.
3.2.4. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình chiết tách
Quá trình tiến hành như sau: Mẫu nước tiểu lưu giữ trong tử lạnh được rã đông ở 37 oC và được ly tâm trong 5 phút (2500 rpm), hỗn hợp dung dịch chuẩn và nội chuẩn được thêm vào để nồng độ cuối cùng đạt 200 ppb. Mẫu nước tiểu được ổn định tại các điểm pH khác nhau: 5, 6, 7 và 8.
Mẫu nước tiểu được chuẩn bị chiết bằng việc sử dụng kỹ thụât chiết phân tán với dung môi Acetonitril. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của
các chất nhóm chẹn beta để xem xét ảnh hưởng của pH tới việc xác định các chất nhóm chẹn beta . Kết quả thu được trong bảng 15 như sau:
Bảng 15. Độ thu hồi với các giá trị pH khác nhau
Độ pH 5 6 7 8 TT Tên Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD 1 Acebutolol 92,1 4,5 81,0 7,2 85,6 7,0 83,6 7,6 2 Alprenolol 97,4 4,7 86,3 8,1 82,3 3,8 90,4 11,2 3 Atenolol 100,3 9,2 91,4 3,6 88,4 7,4 85,5 2,5 4 Betaxolol 87,6 9,5 92,7 6,4 80,7 10,2 90,2 2,4 5 Celiprolol 93,7 6,3 101,2 8,0 83,8 9,5 69,3 2,1 6 Esmolol 98,2 8,5 99,3 11,4 81,5 6,4 91,5 2,6 7 Labetolol 95,5 11,1 90,1 3,5 90,3 6,7 96,7 2,4 8 Levobunolol 97,1 6,2 91,5 10,2 95,4 13,2 94,1 2,0 9 Metoprolol 91,4 3,4 79,3 8,7 84,6 5,5 94,5 8,4 10 Propranolol 86,7 14,2 88,4 6,4 88,2 14,2 97,2 2,4
Kết quả sự ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thu hồi của các chất nhóm chẹn beta có thể được biểu diễn theo hình 17 dưới đây:
Dựa vào bảng kết quả độ thu hồi với các giá trị pH khác nhau, ta thấy:
Ở pH = 5: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 86,7 – 100,3% với độ lệch chuẩn tương đối từ 3,4 – 14,2%.
Ở pH = 6: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 79,3 – 101,2% với độ lệch chuẩn tương đối từ 3,5 – 11,4%.
Ở pH = 7: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 80,7 – 95,4% với độ lệch chuẩn tương đối từ 3,8 – 14,2%.
Ở pH = 8: độ thu hồi của các chất nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 69,3 – 97,2% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,0 – 11,2%.
Kết quả thu được cho thấy, độ pH từ 5 – 8 không ảnh hưởng tới việc xác định các chất nhóm chẹn beta trong mẫu. Do đó, pH khơng ảnh hưởng đến q trình chiết tách mẫu.
3.2.5. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu
Mẫu nước tiểu được chuẩn bị sẵn trong ống Teflon 50 ml với các thể tích mẫu khác nhau: 5ml; 10ml và 15ml. Tiến hành chiết mẫu bằng dung môi Acetonitril sử dụng kĩ thuật chiết pha rắn phân tán. Sau khi mẫu chiết xong, tiến hành xác định độ thu hồi của các nhóm chẹn beta để xem xét ảnh hưởng của thể tích mẫu tới việc xác định nhóm chẹn beta. Kết quả thu được được thể hiện trong bảng 16 dưới đây:
Bảng 16. Độ thu hồi với các thể tích mẫu khác nhau
TT Thể tích 5 ml 10 ml 15 ml
Tên Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD
1 Acebutolol 100,4 7,2 82,6 9,3 110,3 16,1 2 Alprenolol 111,2 10,4 102,4 7,5 97,5 18,4 3 Atenolol 87,6 4,7 99,6 9,4 116,1 16,5 4 Betaxolol 96,0 14,5 92,5 5,8 106,4 11,3 5 Celiprolol 116,3 11,2 106,3 4,6 103,6 18,1 6 Esmolol 88,7 7,3 102,2 10,3 109,4 10,8 7 Labetolol 78,5 7,8 117,1 3,8 106,7 14,6 8 Levobunolol 106,3 17,4 91,5 10,1 115,3 13,5 9 Metoprolol 109,1 11,1 94,3 7,6 105,5 19,4 10 Propranolol 74,9 2,5 106,4 2,7 108,2 12,7 Max 116,3 17,4 117,1 10,1 116,1 19,4 Min 74,9 2,5 82,6 2,7 97,5 10,8
Hình 18. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tới độ thu hồi các nhóm chẹn beta Với thể tích 5 ml: độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động trong khoảng Với thể tích 5 ml: độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 74,9 – 116,3% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,5 – 17,4%.
Với thể tích 10 ml: độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 82,6 – 117,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,7 – 10,1%.
Với thể tích 15 ml: độ thu hồi của các nhóm chẹn beta dao động trong khoảng 97,5 – 116,1% với độ lệch chuẩn tương đối từ 10,8 – 19,4%.
Dựa trên các kết quả thu được, thể tích mẫu là 10 ml giá trị độ thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối là tốt nhất. Do đó, chúng tơi lựa chọn thể tích mẫu là 10ml cho nghiên cứu này.
3.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của chất làm sạch
Việc làm sạch mẫu là yếu tố cần thiết trong quá trình chuẩn bị mẫu. Việc làm sạch mẫu này cũng đòi hỏi phải giảm thiểu tối đa việc mất chất cần phân tích. Dựa trên đặc thù của nền mẫu nước tiểu bao gồm một số thành phần như các ion vô cơ (Na+, Cl-, Ca+2, NH4+, Mg+2, PO4-3, SO4-2), các thành phần hữu cơ (urê, creatinin, acid uric, các acid amin, các hormon, vitamin, enzym, vitamin B1, vitamin PP, vitamin C, các hormon sinh dục nam, nữ, hormon vỏ thượng thận) nên nhóm nghiên cứu sử dụng các loại chất hoá học sau trong việc làm sạch mẫu: Florisil, C18, PSA.
dịch chiết bằng 50 mg Florisil, C18 và PSA để xác định độ thu hồi của các chất cần phân tích sau khi làm sạch mẫu. Kết quả thu được như sau
Bảng 17. Độ thu hồi khi sử dụng các chất hấp thụ cho công tác chiết mẫu
TT Chất hấp thụ 50 mg Florisil 50 mgC18 50 mg PSA
Tên Rec. % RSD Rec. % RSD Rec. % RSD
1 Acebutolol 82,5 11,3 61,1 13,1 76,0 8,3 2 Alprenolol 62,4 5,5 60,4 5,7 75,3 6,7 3 Atenolol 89,1 17,1 88,3 4,3 80,6 2,5 4 Betaxolol 81,7 13,6 85,2 10,2 86,2 2,4 5 Celiprolol 85,3 12,8 87,5 8,5 83,1 6,1 6 Esmolol 91,4 15,4 95,0 9,4 78,6 6,5 7 Labetolol 83,2 10,6 85,6 3,8 84,5 9,4 8 Levobunolol 91,0 10,3 81,7 11,1 77,4 8,7 9 Metoprolol 83,4 14,7 76,3 11,4 83,2 11,2 10 Propranolol 80,2 8,8 82,5 7,5 87,2 10,4 Min 62,4 5,5 60,4 3,8 75,3 2,5 Max 91,4 17,1 95,0 13,1 87,2 11,2
Kết quả khảo sát cho thấy, đối với Florisil: độ thu hồi của nhóm chẹn beta dao động từ 62,4 đến 91,0% với độ lệch chuẩn tương đối từ 5,5 đến 17,1%.
Đối với C18: độ thu hồi của nhóm chẹn beta dao động từ 60,4 đến 95,0% với độ lệch chuẩn tương đối từ 3,8 đến 13,1%.
Đối với PSA: độ thu hồi dao động từ 75,3 đến 87,2% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2,5 đến 11,2%.
Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi chọn chất làm sạch là PSA với hàm lượng 50 mg cho công tác làm sạch mẫu.
PSA là một trong những chất hấp thụ được sử dụng nhiều trong việc làm sạch các chất ảnh hưởng khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ký.
Cơng thức hóa học của PSA: SiCH2CH2CH2NHCH2 CH2NH2. Có thể thấy, PSA có 2 điểm có khả năng trao đổi ion (pKa = 10,1 và 10,9) nên có khả năng hấp thụ nhiều loại chất ảnh hưởng có độ phân cực khác nhau cũng như tính chất hóa học khác nhau như đường, chất béo, chlorophyll…Trong thành phần nước tiểu cũng chứa một số các axit hữu cơ như: axit béo và một số loại sắc tố. Vì vậy, chúng tơi chọn PSA là chất hấp thụ cho công tác làm sạch mẫu.
3.3. Xây dựng quy trình phân tích
Từ những kết quả khảo sát điều kiện tối ưu như trên, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình phân tích như sau:
3.3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu
10ml mẫu + 10ml Acetonitril cho vào ống Teflon 50ml
Thêm 4 g MgSO4 + 1 g NaCl
Lắc trong vòng 3 trên Máy lắc votex
Hút 1 ml dung dịch vào vial 1,8 ml Ly tâm trong 5 phút, tốc độ 4000 vòng/phút
Lắc trong vòng 1 phút
Hút 2 ml dung dịch phía trên chuyển vào ống 5ml chứa sẵn