2.2.3. Định lượng nhóm chẹn beta bằng LC/MS/MS
Là một kỹ thuật tiên tiến mới được phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây trên thế giới và đã, đang và sẽ được áp dụng trong lĩnh vực phân tích chuyên sâu, đặc biệt cho các phép phân tích địi hỏi độ nhạy và độ chính xác cao.
Cơ chế hoạt động của kỹ thuật này được giải thích cơ bản như sau:
Hệ thống sắc kí LC/MS/MS bao gồm một hệ thống sắc kí lỏng được ghép nối với các detector khối phổ. Trong đó, chức năng của hệ thống sắc kí lỏng giống như các hệ thống sắc kí cổ điển khác là giúp tách các chất cần phân tích riêng biệt. Sau khi các chất cần phân tích được tách từ hệ thống sắc kí lỏng sẽ được chuyển sang hệ thống khối phổ. Mẫu tại hệ thống khối phổ trước sẽ được mù hóa (spray) tạo thành các hạt nhỏ và tiếp theo sẽ chuyển tới hệ khối phổ đầu tiên (hình 2). Tại hệ thống khối phổ thứ nhất (MS1), chất cần phân tích sẽ được cung cấp năng lượng (Fracmentor voltage) bắn phá để tạo ra Precusor ion (Mother ion +1, +2,...). Sau khi được phân mảnh, Precusor ion này của chất cần phân tích sẽ đi vào hệ thống Collision cell. Tại Collision cell, Precusor ion của chất cần phân tích sẽ bị bắn phá
tiếp lần thứ 2 bởi khí trơ (thường là N2, He) để tạo thành các Product ions và các product ions này sẽ được nhận biết bởi hệ thống MS2.
Hình 2 : Hệ thống MSMS (Q1, Q3 : mass spectrometer ; q2: collision cell)
2.2.3. Phƣơng pháp xử lý và đánh giá kết quả
Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn thì thời gian lưu của chất là đại lương đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Cịn chiều cao và diện tích pic sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một khoảng nồng độ xác định và khơng lớn, chúng có mối quan hệ tuyến tính như sau:
Hi = k1.Ci = f(C)
Si = k2.Ci = f(C) Trong đó:
Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của cấu tử i. Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi.
k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký. của pha tĩnh cũng như khí mang.
Dựa vào cơng thức trên có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê với các thông số đặc trưng sau :
+ Giá trị trung bình: 1 1 n i i x x n
+ Độ lệch chuẩn: 2 1 ( ) 1 n i i x x s n
+ Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) s.100
x
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị thơng dụng của phịng thí nghiệm
Thiết bị li tâm lạnh; Các loại pipet tự động; Máy đo pH; Cột sắc kí C18; Cân kỹ thuật (4 số); Máy lắc cỡ nhỏ (vortex mixer).
Hệ thống khối phổ triple QuadMS/MS 6410 của hãng Agilent với phần mềm Mass Hunter được sử dụng để điều khiển và xử lý số liệu;
Hệ sắc ký lỏng 1200 series với bơm binary, auto sampler của hãng Agilent được kết nối với hệ thống khối phổ;
2.3.2. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất có độ tinh khiết cao.
- Nước cất đạt 18 m được cung cấp bởi hệ thống Ultra-pure (Sinhan Science Tech, Hàn quốc).
- MeCN, MeOH, n-hexane, Acetone, Ethylacetate, acid acetic, acid formic tinh khiết sắc kí được mua từ J.T. Baker (Philipsburg, Mỹ).
- MgSO4 khan, NaCl được mua từ Wako (Osaka, Nhật bản).
- Acid acetic, acid formic tinh khiết sắc kí được mua từ Sigma Aldric (Đức).
- Các chất chuẩn , nội chuẩn cho phân tích doping được mua từ Viện Đo lường quốc gia Úc, hãng Fluka (Đức), EDOM (Mỹ), Chemservice (West Chester, PA, Mỹ), Dr. Ehrenstorfer (Ausberg, Đức). Độ tinh khiết của các chất chuẩn hóa chất này từ 96% - 99%.
2.3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 1.00 mg/ml
Cân chính xác khoảng 0,01 g các chất trong nhóm chẹn beta vào từng lọ thuỷ tinh màu, hịa tan vào từng bình định mức 10ml và định mực đến vạch bằng acetonitril. Chuẩn gốc được lưu giữ trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ - 20 oC.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn thứ cấp 50 µg/ml
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp thứ cấp 50 µg/ml : Hút chính xác 250 µg/ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất trong nhóm chẹn beta 1.00 mg/ml cho vào bình định mức 5 ml và định mực đến vạch bằng acetonitril
Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc của các nhóm chẹn beta tại các nồng độ:
500ng/ml; 200 ng/ml; 100ng/ml; 50 ng/ml; 20ng/ml.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu, lựa chọn các điều kiện vận hành trên hệ thiết bị LC/MS/MS. 3.1.1 Nghiên cứu, lựa chọn các điều kiện phần khối phổ (MS/MS)
3.1.1.1. Lựa chọn thế phân tách mảnh cho các chất nghiên cứu
Việc lựa chọn thế phân tách mảnh được tiến hành như sau: Dung dịch chất chuẩn 1 ppm của từng chất nghiên cứu được bơm vào hệ thống khối phổ thông qua hệ thống LC ở chế độ Scan. Dựa trên tín hiệu thu được (intensity) của từng chất nghiên cứu đối với các điều kiện thế phân tách mảnh khác nhau để từ đó lựa chọn được thế phân tách mảnh thích hợp cho từng chất nghiên cứu, phục vụ cho các bước thực nghiệm lựa chọn các điều kiện thích hợp cho phần phân tích khối phổ tiếp theo.
Các điều kiện máy xác định thế phân tách mảnh của các chất nhóm chẹn beta trong bảng 5 như sau:
Bảng 5. Điều kiện máy xác định thế phân tách mảnh của các chất nghiên cứu
STT Thông số Điều kiện
1 Thế mao quản (Capillary voltage) 4.0 kV
2 Áp suất buồng bơm mẫu (Nebulizer pressure) 10 psi
3 Tốc độ khí N2 (Gas flow) 6L/phút
4 Nhiệt độ bay hơi (Temp.) 350 oC
Trước tiên, khảo sát thế phân tách mảnh cho 10 chất nhóm chẹn beta lần lượt là 50, 70, 90, 110, 130, 150 và 170V.
Kết quả khảo sát thế phân tách mảnh cho Acebutalol như sau:
Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70
Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110
Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150
Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 125 – 155 Hình 3. Thế phân tách mảnh cho Acebutalol
Kết quả cho thấy, tại thế phân tách trong khoảng 130V - 150V, cường độ tín hiệu là tốt nhất. Do vậy, thế phân tách mảnh với độ phân giải nhỏ hơn đã được tiếp tục khảo sát để tìm cường độ bắn phá tối ưu. Tiến hành khảo sát tại các thế: 125, 135, 145 và 155V. Từ số liệu thu được trên hình 3, thế phân tách mảnh được lựa chọn cho Acebutalol là 145V.
Tiến hành khảo sát thế phân mảnh cho các chất cịn lại, thế phân tách mảnh thích hợp nhất cho các chất nhóm chẹn beta được tổng kết trong bảng 6 như sau
Bảng 6. Thế phân tách mảnh thích hợp cho các chất nhóm chẹn beta
TT Tên Thế phân tách mảnh (V) 1 Acebutolol 145 2 Alprenolol 115 3 Atenolol 130 4 Betaxolol 135 5 Celiprolol 170 6 Esmolol 130 7 Labetolol 110 8 Levobunolol 110 9 Metoprolol 130 10 Propranolol 130
3.1.1.2. Lựa chọn ion chính (Mother ion) cho từng chất nghiên cứu
Dựa việc xác định thế phân tách mảnh của 10 chất nhóm chẹn beta, ion chính của các chất sẽ được chọn dựa trên sắc đồ phổ khối của từng chất. Ion chính của 10 chất nhóm chẹn beta được lựa chọn trong bảng 7 như sau.
Bảng 7. Lựa chọn ion chính thích hợp cho các chất nhóm chẹn beta
TT Tên chất Ion chính (m/z) 1 Acebutolol 337 2 Alprenolol 250 3 Atenolol 267 4 Betaxolol 308 5 Celiprolol 380 6 Esmolol 296 7 Labetolol 329 8 Levobunolol 292 9 Metoprolol 268 10 Propranolol 260
3.1.1.3. Lựa chọn ion chuyển hóa hóa (MRM)
a) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Acebutolol
Ion chính của Acebutolol có số khối là 337, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Acebutolol là các mảnh có số khối 116 và 260. Ion chuyển hóa m/z =116 là ion hay gặp của các chất chẹn beta. Phân mảnh ở liên kết C- O của nhóm phenol ete sẽ cho mảnh m/z =116.
Píc ion chuyển hóa 260 ứng với (M+ + H) – 77 là ion thường gặp. Việc mất một phân tử H2O và đứt mạch ở liên kết C-N và việc loại bỏ phân tử C3H7NH2 cho ion (M+ + H) – H2O- C3H7NH2 tương ứng với mảnh m/z = 260.
Hình 4 thể hiện ion chuyển hóa của Acebutalol tại thế phân tách 145V. Dựa trên sắc đồ thu được, ion chuyển hóa được lựa chọn cho Acebutalol là 116 và 260.
b) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Alprenolol
Ion chính của Alprenolol có số khối là 250, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Alprenolol là các mảnh có số khối 116 và 173. Các ion chuyển hóa 116 và 173 ứng với (M+ + H) - 77 là các píc thơng thường và được hình thành tương tự như hợp chất Acebutolol. Tại thế phân tách là 115V, ion chuyển hoá của Alprenolol được lựa chọn cho Alprenolol là 116 và 173.
Hình 5 . Ion chuyển hố cho Alprenolol
c) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Atenolol
Ion chính của Atenolol có số khối là 267, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Atenolol là các mảnh có số khối 145 và 190. Peak 190 là píc ứng với (M+ + H) – 77, píc ion 145 là píc riêng biệt của Atenolol khi mất thêm nhóm amide CO-NH3 từ ion chuyển hóa với mảnh có m/z = 190.
Hình 6 thể hiện ion chuyển hoá của Atenololtại thế phân tách 110V. Ion chuyển hoá được lựa chọn cho Atenolol là 145 và 190.
Hình 6. Ion chuyển hố cho Atenolol
d) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Betaxolol
Ion chính của Betaxolol có số khối là 308, hai ion chuyển hố được lựa chọn cho Betaxolol là các mảnh có số khối 116 và 231. Các píc ion m/z =116 và 231 là các ion thường gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M+ + H) - 77, tương tự như trường hợp của Acebunolol và Alprenolol.
Tại thế phân tách 120V, ion chuyển hoá của Betaxolol được lựa chọn là 116 và 231.
Hình 7 . Ion chuyển hoá cho Betaxolol
e) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Celipprolol
Ion chính của Celiprolol có số khối là 380, hai ion chuyển hố được lựa chọn cho Celiprolol là các mảnh có số khối 251 và 307. Píc ion m/z = 307 được tạo thành do đứt liên kết C - N để loại phân tử C4H9NH2. Píc m/z = 251 là do ion 307 – 56 được tạo thành do mất thêm 4 nhóm CH2 từ ion m/z =307.
Ion chuyển hố của Celiprolol tại thế phân tách 170V được lựa chọn là 251 và 307.
Hình 8. Ion chuyển hố cho Celiprolol
f) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Esmolol
Ion chính của Esmolol có số khối là 296, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Esmolol là các mảnh có số khối 145 và 219. Píc ion m/z = 219 (M+ + H) - 77 là píc thường gặp đối với nhóm chẹn beta. Tiếp đó, sự gãy liên kết ở vị trí C - C loại nhóm CH2COOCH3 để tạo phân mảnh ion với m/z là 145.
Hình 9 thể hiện ion chuyển hoá của Esmolol tại thế phân tách 140V. Dựa trên cường độ này, ion chuyển hoá được lựa chọn cho Esmolol là 145 và 219.
Hình 9. Ion chuyển hố cho Esmolol
g) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Labetolol
Ion chính của Labetolol có số khối là 329, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Labetolol là các mảnh có số khối 162 và 311. Mất phân tử nước từ Labetolol sẽ cho píc ion với m/z = 311 là peak của (M+ + H) – 18. Việc gãy liên kết C - C cho ion có mảnh 162.
Tại thế phân tách 120V, ion chuyển hoá của Labetolol được lựa chọn là 162 và 311.
Hình 10. Ion chuyển hố cho Labetolol
h) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Levobunolol
Ion chính của Levobunolol có số khối là 292, hai ion chuyển hố được lựa chọn cho Levobunolol là các mảnh có số khối 201 và 236. Với phân tử có nhóm tert-butyl, gãy liên kết C - N loại bỏ một phân tử isobutene sẽ cho píc ion chuyển hóa (M+ + H) – 56. Mất phân tử nước (H2O = 18) và nhóm tert-butyl amin (C4H9NH2 = 63) sẽ cho píc ion với m/z = 201 là píc của (M+ + H) – 91
Hình 11 thể hiện ion chuyển hoá của Levobunolol tại thế phân tách là 120V. Dựa trên cường độ này, ion chuyển hoá được lựa chọn cho Levobunolol là 201 và 236.
Hình 11. Ion chuyển hoá cho Labetolol
i) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Metoprolol
Ion chính của Metoprolol có số khối là 268, hai ion chuyển hoá được lựa chọn cho Metoprolol là các mảnh có số khối 116 và 191. Các píc ion m/z =116 và 191 là các ion thường gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M+ + H) - 77, tương tự như trường hợp của Acebunolol và Alprenolol
Ion chuyển hoá của Metoprolol tại thế phân tách 110V được lựa chọn là 116 và 191.
Hình 12. Ion chuyển hố cho Metoprolol
j) Lựa chọn ion chuyển hóa cho Propranolol
183 là các ion thường gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M+ + H) - 77, tương tự như trường hợp của Acebunolol và Alprenolol
Tại thế phân tách là 130V, ion chuyển hoá của Propranolol được lựa chọn là 116 và 183.
Hình 13. Ion chuyển hố cho Propranolol
Tóm lại: Ion chuyển hóa thích hợp nhất cho các chất nhóm chẹn beta được
tổng hợp trong bảng 8 sau đây:
Bảng 8. Lựa chọn ion chuyển hố thích hợp cho các chất nhóm chẹn beta
TT Tên Ion chuyển hóa (m/z)
TT Tên Ion chuyển hóa (m/z) 3 Atenolol 145 190 4 Betaxolol 161 231 5 Celiprolol 251 307 6 Esmolol 145 219 7 Labetolol 162 311 8 Levobunolol 201 236 9 Metoprolol 116 133 10 Propranolol 116 183
3.1.1.4 . Lựa chọn năng lượng bắn phá (Collision energy) cho các ion chuyển hóa
Tiến hành khảo sát năng lượng bắn phá từ 0 – 30V cho 10 chất nhóm chẹn beta. Dựa trên cường độ tín hiệu của sắc đồ phổ khối thu được, năng lượng bắn phá được lụa chọn cho từng chất cụ thể như sau: Tiến hành khảo sát năng lượng bắn phá cho Acebutalol. Kết quả cho thấy, tại khoảng năng lượng bắn phá từ 0 – 30V, cường độ tín hiệu thu được đối với Acebutalol tốt nhất là 20V.
Hình 14. Năng lượng bắn phá cho Acebutalol (0 – 30)
Tiến hành khảo sát tương tự với các chất nhóm chẹn beta, năng lượng bắn phá thích hợp nhất cho các chất nhóm chẹn beta được tổng hợp trong bảng 9 sau:
Bảng 9. Năng lượng bắn phá thích hợp cho nhóm chẹn beta
TT Tên Năng lƣợng bắn pha (V)
1 Acebutolol 20
5 Celiprolol 20 6 Esmolol 20 7 Labetolol 20 8 Levobunolol 20 9 Metoprolol 15 10 Propranolol 20
Qua quá trình khảo sát các điều kiện cho phần khối phổ, các điều kiện tối ưu nhất được tóm tắt trong bảng 10 như sau:
Bảng 10. Các điều kiện cho phần MS
TT Tên chất Thế phân tách mảnh (v) Ion chính (m/z) Năng lƣợng bắn phá (v) Ion chuyển hóa (m/z) 1 Acebutolol 145 337 20 116; 260 2 Alprenolol 115 250 20 116; 273 3 Atenolol 130 267 15 145; 190 4 Betaxolol 135 308 20 161; 231 5 Celiprolol 170 380 20 251; 307 6 Esmolol 130 296 20 145; 219 7 Labetolol 110 329 20 162; 311 8 Levobunolol 110 292 20 201; 236 9 Metoprolol 130 268 15 116; 133 10 Propranolol 130 260 20 116; 183
3.1.2. Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện cho phần LC
3.1.2.1. Lựa chọn pha động
Pha động là yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp chất phân tích. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ đơn như methanol, axetonitril, benzene, n-hexan hoặc nước, hoặc cũng có thể là hỗn hợp của hai hay ba dung môi được trộn với nhau theo những tỉ lệ nhất định phù hợp. Ví dụ như hỗn hợp methanol với nước (MeOH/H2O) trong tỉ lệ 70/30, axetonitril với nước
(MeCN/H2O) trong tỉ lệ 80/20. Nó cũng có thể là dung mơi nước có chưa thêm các chất đệm pH, chất ligan tạo phức, chất làm chậm với nồng độ nhất định thích hợp.