CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm
3.1.6. Bộ kit hoàn chỉnh
Hình 3.8. Bộ kit HPV Genotypes qPCR mini kit
Hình ảnh bộ kit HPV Genotypes qPCR mini kit đƣợc thể hiện ở Hình 3.8, cung cấp đầy đủ thành phần hóa chất để thực hiện xét nghiệm định type HPV trên 48 mẫu dịch phết cổ tử cung và sẵn sàng để sử dụng. Bộ kit có 48 ống master Mix 1 và 48 ống master Mix 2. Mỗi ống gồm các thành phần: nguyên liệu cho phản ứng real time PCR, mồi, đầu dị đặc hiệu, có thể tích 20µL đƣợc đựng trong ống
eppendorf 0.1ml. 01 ống chứng dƣơng 1 là hỗn hợp plasmid HPV 6, 16, 31 v IC nng 5ì103
bn sao/àl, 01 ng chứng dƣơng 2 là hỗn hợp plasmid HPV 11, 18, 33/52 v IC nng 5ì103 bn sao/àl cú th tích 45µL. 01 đối chứng âm là plasmid IC nồng 5ì103
bn sao/àl th tớch 100 àL.
Do s biến động di truyền của HPV giữa các khu vực khác nhau và sự liên quan của chúng với bệnh tật ngày càng đƣợc chứng minh nên có rất nhiều nghiên cứu phát hiện HPV nói chung và phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex real time PCR nói riêng. Một số nghiên cứu phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex real time PCR có đƣa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của phƣơng pháp thơng qua việc tính số bản sao thấp nhất mà kỹ thuật real time PCR phát hiện đƣợc nhƣ nghiên cứu của Seman và cộng sự (2010) có đƣa ra phƣơng pháp phát hiện sự có mặt của các type HPV 6, 11, 16, 18 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật real time PCR với giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 2.101
đến 2.106 bản sao/phản ứng [39] và nghiên cứu của Daojun Yu và cộng sự (2012) sử dụng đầu dò huỳnh quang AllGlo mới, đạt độ nhạy từ 101 đến 102
bản sao/phản ứng, phạm vi tuyến tính từ 101 đến 108 bản sao/phản ứng [46]. Từ đó có thể so sánh với phƣơng pháp chúng tơi phát triển thì kết quả về độ nhạy trong các nghiên cứu này là tƣơng đƣơng. Trong nghiên cứu, chúng tôi đã đƣa ra đƣợc độ nhạy của các type HPV 6, 11, 16, 18 là 5.101
bản sao/phản ứng. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tơi có thể phát hiện đƣợc 16 type HPV đồng thời trong hai ống phản ứng. Số lƣợng các type HPV phát hiện đƣợc nhiều hơn bốn lần so với hai nghiên cứu có cùng độ nhạy. Đối với các nghiên cứu khác có số lƣợng type HPV phát hiện tƣơng đƣơng nhƣ nghiên cứu của Lindh M và cộng sự (2007) phát hiện 14 type HPV (12 type nguy cơ cao và 2 type nguy cơ thấp) cần tới trong 15 type PCR riêng biệt [30], nghiên cứu của Lee J.H và cộng sự (2010) phát hiện 15 type HPV nguy cơ cao thực hiện trong 5 ống phản ứng real time PCR: ống 1 (HPV 16, 56 và 58), ống 2 (18, 52 và 33), ống 3 (39, 35 và 45), ống 4 (51, 31 và 59) và ống 5 (26, 68 và 66) [28] thì phƣơng pháp của chúng tôi tối ƣu hơn và tiết kiệm hơn về hóa chất, sinh phẩm. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Lindh M và Lee J.H đều chƣa đƣa ra đƣợc giới hạn phát hiện của phƣơng pháp.
So sánh bộ kit chế tạo với một số kit thƣơng mại uy tín có số lƣợng type tƣơng đƣơng nhƣ Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, Thuỵ sĩ) [50], nhà sản xuất đã đƣa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của kit đối với các type HPV 16/ 18/ 31/ 33/ 35/ 39/ 45/ 51/ 52/ 56/ 58/ 59/ 66/ 68 lần lƣợt là 600/ 600/ 300/ 300/ 1200/ 150/ 300/ 1200/ 4800/ 2400/ 600/ 600/ 1200/ 300 (khoảng từ 102 đến 103 bản sao/ml) trong mẫu dịch phết cổ tử cung. Trong bộ kit, cứ 200 µL dịch phết cổ tử cung tách chiết bằng kit tách chiết ADN của Roche thu đƣợc 50 µL ADN. Tƣơng ứng với nồng độ ADN 1 bản sao/µL là 250 bản sao/ml dịch tách chiết. Nhƣ vậy, giới hạn của các type HPV với bộ kit Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, USA) đối với các type HPV 16/ 18/ 31/ 33/ 35/ 39/ 45/ 51/ 52/ 56/ 58/ 59/ 66/ 68 lần lƣợt là 2/ 2/ 1/ 1/ 5/ 1/ 1/ 5/ 20/ 10/ 2/ 2/ 5/ 1 bản sao/µL. Nếu dựa trên thơng tin cơng bố này của nhà sản xuất thì độ nhạy của Cobas® HPV Test tốt hơn so với độ nhạy của kit HPV đƣợc phát triển trong nghiên cứu. Đối với kit HPV Genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) nhà sản xuất chƣa đƣa ra đƣợc các thông số về độ nhạy cụ thể.
Với một số kit thƣơng mại phát hiện số type HPV ít hơn nhƣ HPV 6/11 Real- TM (Sacace, Italy) phát hiện 2 type 6,11 và HPV 16/18 Real-TM Quant (Sacace, Italy) phát hiện 2 type 16, 18 [53], nhà sản xuất công bố kit có độ nhạy 500 bản sao/ml [52]. Trong bộ kit tách, cứ 200µL dịch phết cổ tử cung tách chiết thu đƣợc 50 µL ADN. Tƣơng ứng với nồng độ ADN 1 bản sao/µL là 250 bản sao/ml dịch tách chiết. Lƣợng ADN bổ sung cho mỗi phản ứng là 10 µL. Do đó, độ nhạy của kit tƣơng đƣơng 2,0.101
bản sao/phản ứng. Nhƣ vậy, độ nhạy của kit HPV trong nghiên cứu cũng thấp hơn khoảng 2 lần so với hai bộ kit thƣơng mại HPV 6/11 Real-TM và HPV 16/18 Real-TM Quant.
Tuy có độ nhạy thấp hơn so với một số kit thƣơng mại uy tín, nhƣng bộ kit chế tạo trong nghiên cứu này cho thấy có những ƣu điểm nhất định, giải quyết đƣợc những tồn tại hiện nay của các kit thƣơng mai nhƣ:
- HPV- Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, USA) phát hiện 14 type nguy cơ cao [50], không phát hiện đƣợc HPV type nguy cơ thấp, chỉ sử dụng đƣợc trên hệ thống
kín, tự động của hãng nên rất hạn chế các phịng thí nghiệm ở tuyến tỉnh trở xuống có thể sử dụng.
- HPV Genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) phát hiện đƣợc 14 type nguy cơ cao nhƣng phải sử dụng 4 ống: Ống 1 phát hiện 16, 18, 31, IC; Ống 2 phát hiện 39, 45, 59, IC; Ống 3 phát hiện 33, 35, 56, 68; và ống 4 phát hiện 51, 52, 58, 66 và chƣa đƣa ra đƣợc các thông số về độ nhạy và độ đặc hiệu của kit [54]. Nếu muốn phát hiện đồng thời cả HPV 6/11 thì phải sử dụng thêm HPV 6/11 Real-TM.
- Hai kit HPV 6/11 Real-TM và HPV 16/18 Real-TM Quant chỉ phát hiện đƣợc 2 type HPV (6 và 11 hoặc 16 và 18), số lƣợng type HPV phát hiện đƣợc nhỏ hơn gấp 8 lần so với bộ kit trong nghiên cứu.
Tại Việt Nam, có bộ kit AccuPid HR-HPV Genotyping Kit (Khoa Thƣơng - Việt Nam) phát hiện 14 type nguy cơ cao, công bố độ nhạy của từng type giao động ở 6 - 50 bản sao/phản ứng [49]. Tuy nhiên, nhà sản xuất chƣa công bố thành phần, cơng thức của kit nên khó so sánh chất lƣợng.
Do các ƣu điểm trên, bộ kit trong nghiên cứu có thể sử dụng để chẩn đoán phân biệt các type HPV có nguy cơ cao và nguy cơ thấp giúp phân loại, điều trị, theo dõi ở những bệnh nhân bị nhiễm HPV, xác định vai trò của các type HPV trong các trƣờng hợp đồng nhiễm. Qua đó có thể tầm sốt nguy cơ ung thƣ cổ tử cung cho phụ nữ và một số nguy cơ khác do HPV gây ra nhƣ mụn cóc sinh dục, sùi mào gà, ung thƣ dƣơng vật. Ngồi ra, bộ kit cịn có thể sử dụng để đánh giá hiệu quả của vắc xin 9 giá (Gardasil 9), một loại vắc xin đã đƣợc sử dụng để phòng ngừa các type HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 vào tháng 12/2014.
3.2. Đánh giá sự tƣơng đồng của bộ kit mới chế tạo với kit thƣơng mại có uy tín (Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) và HPV 6/11 Real - TM, Italy).
Bảng 3.4. So sánh phương pháp mới xây dựng với sinh phẩm thương mại.
Cobas®HPV
test và HPV 6/11 Real-TM
Phƣơng pháp trong nghiên cứu Tổng
cộng Âm tính HPV 16 HPV 18 12 type Hr HPV 16 và Hr HPV 6 HPV 11 Âm tính 20 20 HPV 16 5 5 HPV 18 4 4 12 type Hr 1 12 13 HPV 16 và Hr 1 2 3 HPV 6 3 3 HPV 11 2 2 Tổng 22 5 4 12 2 3 2 50
Tổng số 20 mẫu ADN âm tính và 30 mẫu ADN dƣơng tính với các type HPV trong nghiên cứu đã đƣợc sử dụng để đánh giá sự tƣơng đồng giữa phƣơng pháp trong nghiên cứu và kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) và HPV 6/11 Real-TM (Sacace - Italy) là hai kit đã đƣợc cấp chứng nhận IVD. Kít Cobas®HPV test đã đƣợc FDA chấp thuận cho sàng lọc tầm soát ung thƣ cổ tử cung. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4 cho thấy trong 20 mẫu âm tính đƣợc thử nghiệm so sánh, khơng thấy có sự sai khác về kết quả xét nghiệm. Trong số 13 mẫu dƣơng tính với 12 type HPV nguy cơ cao, có 01 trƣờng hợp âm tính khi thử nghiệm với phƣơng pháp trong nghiên cứu. Trong 3 mẫu dƣơng tính đồng thời với HPV 16 và HPV nguy cơ cao có 1 trƣờng hợp âm tính với phƣơng pháp trong nghiên cứu (âm tính với HPV 16). Ngun nhân có thể do độ nhạy của một số type HPV trong bộ kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) là tốt hơn so với bộ kit mới xây dựng.Những trƣờng hợp khác biệt giữa hai kit là do mẫu có nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm thấp (Ct ≥ 30) tƣơng đƣơng với nồng độ ADN < 103 bản sao/µl.
Kết quả so sánh đƣợc chuyển thành Bảng 3.5 để đánh giá sự tƣơng đồng giữa phƣơng pháp trong nghiên cứu với hai kit thƣơng mại
Bảng 3.5. Sự tương đồng giữa kit trong nghiên cứu và kit thương mại.
Kit trong nghiên cứu (Dƣơng tính)
Kit trong nghiên cứu (Âm tính)
Tổng số
Kit thƣơng mại
(Dƣơng tính) 28 2 30
Kít thƣơng mại
(Âm tính) 0 20 20
Tổng số 28 22 50
Tiến hành đánh giá sự tƣơng đồng giữa kit trong nghiên cứu với kit thƣơng mại thông qua hệ số phù hợp Kappa, có đƣợc chỉ số OA: 0,96%, EA: 0,48%. Từ đó, nhóm nghiên cứu đƣa ra đƣợc tỷ lệ tƣơng đồng kit trong nghiên cứu với kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) và HPV 6/11 Real-TM (Saccase - Italy) là 92%.
Các phƣơng pháp này đều có những ƣu điểm của kỹ thuật multiplex real time PCR nói chung là nhanh, độ chính xác cao, phát hiện đồng thời nhiều tác nhân. Tuy nhiên, giá thành của bộ kit trong nghiên cứu rẻ hơn đáng kể so với các kit thƣơng mại nhập ngoại, với tổng chi phí chỉ trong khoảng 350-400.000 VNĐ/1 xét nghiệm. Trong khi đó, đối với các kit thƣơng mại của Roche và Sacace, để sàng lọc đƣợc cả các type nguy cơ cao và thấp phải sử dụng hai bộ kit, gây tốn kém về thời gian và sinh phẩm. Chi phí cho xét nghiệm sàng lọc 14 type nguy cơ cao với kit Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, USA) là 750.000 VNĐ/1 xét nghiệm, HPV genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) là 390.000 VNĐ/1 xét nghiệm và HPV 6/11 Real-TM là 178.000 VNĐ/1 xét nghiệm.