Thử nghiệm bộ kit mới xây dựng trên mẫu bệnh nhân

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán đồng thời các genotype HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR (Trang 70)

16/18 7 7

Nguy cơ cao 5 5

Nguy cơ thấp 3 3

16/18 + Nguy cơ cao 1 1

16/18 + Nguy cơ thấp 0 0

16/18 + Nguy cơ cao + Nguy cơ thấp 0 0

Nguy cơ cao + Nguy cơ thấp 0 0

Tỷ lệ nhiễm HPV 16 16

Âm tính 84 84

Kết quả thử nghiệm bộ kit mới xây dựng trên các mẫu thực của những bệnh nhân đến khám tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh trong năm 2017 - 2018 cho thấy: tỷ lệ nhiễm HPV đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật real time PCR là 16% (16 trƣờng hợp). Tỷ lệ này thấp hơn so với nghiên cứu của Cao Minh Nga và cộng sự (2009) là 19,97% [1, 3]. Tuy nhiên, tỷ lệ này cao hơn nhiều so với các nghiên cứu khác ở trong nƣớc nhƣ Phạm Thị Hoàng Anh (2003) là 10,9% [34], Phạm Thọ Dƣợc (2013) là 11,8% [4] và cao hơn rất nhiều so với nghiên cứu của Lê Trung Thọ (2008) là 5,13% [2]. Sự khác biệt là do tiêu chuẩn chọn mẫu. Các tác giả Phạm Thị Hoàng Anh, Phạm Thọ Dƣợc và Lê Trung Thọ chọn mẫu nghiên cứu trong một cộng đồng dân cƣ, có thể có hoặc chƣa có bệnh lý về phụ khoa. Trong nghiên cứu của chúng tôi và Cao Minh Nga, bệnh phẩm đƣợc thu nhận tại cơ sở y tế, nơi bệnh nhân đến để kiểm tra những bất thƣờng đã hiện hữu, do vậy tỷ lệ nhiễm HPV cao hơn so với các nghiên cứu khác trong cộng đồng.

Trong 100 mẫu bệnh phẩm có 7 trƣờng hợp nhiễm type HPV 16/18 (7%), 5 trƣờng hợp nhiễm các type HPV nhóm nguy cơ cao (5%), 3 trƣờng hợp nhiễm type HPV nhóm nguy cơ thấp (3%) và có 1 trƣờng hợp đồng nhiễm HPV type 16/18 và nguy cơ cao (1%). Tỷ lệ nhiễm các type HPV 16/18 43,75%, tỷ lệ nhiễm các type nguy cơ cao 31,25%, tỷ lệ nhiễm các type nguy cơ thấp HPV 6/11 21,4%, tỷ lệ đồng nhiễm 2 type nguy cơ cao 7%. Tuy nhiên do số lƣợng cỡ mẫu thử nghiệm

không lớn (n = 100), thử nghiệm đƣợc tiến hành trên những bệnh có biểu hiện bất thƣờng trên lâm sàng nên nhóm nghiên cứu không so sánh tỷ lệ nhiễm các type HPV với một số nghiên cứu khác tại Việt Nam.

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đạt đƣợc một số kết quả sau:

1. Phát triển thành công kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng đầu dò Taqman cải tiến và bộ kit để phát hiện đồng thời 16 type nguy cơ cao và thấp phổ biến (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, và 68, 6, 11). Phản ứng đƣợc chia thành hai hỗn hợp mix, HPV type 6/11 (kênh HEX), HPV type 16/18 (kênh Cy5), 12 loại nguy cơ cao khác (kênh FAM), gen kiểm soát nội bộ ATCB (kênh Texas). Độ nhạy của phản ứng ở mức 5.101 bản sao/phản ứng đối với các type HPV 6, 11, 18, 31, 33/52, 35 và 5.102 đối với các type HPV 16, 39/68, 45, 51, 56/66, 58, 59 và độ đặc hiệu đạt đƣợc là 100%.

2. So sánh kit tạo thành trong nghiên cứu này với 2 kit thƣơng mại uy tín là Real time Cobas®HPV (Roche Diagnostics) phát hiện 14 type HPV nguy cơ cao và HPV 6/11Real-TM (Sacace) phát hiện 2 type nguy cơ thấp, cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt tới 92%.

3. Thử nghiệm trên 100 mẫu dịch phết cổ tử cung của phụ nữ đến khám tại CDC Bắc Ninh cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV là 16%, 7 mẫu dƣơng tính với HPV 16/18 (7%), 5 mẫu dƣơng tính với 12 type nguy cơ cao (5 %), 3 mẫu dƣơng tính với 6/11 (3 %) và có 1 mẫu đồng nhiễm HPV type HPV 16/18 và nguy cơ cao (1%).

Ngồi ra, nhóm nghiên cứu đã cơng bố 01 bài báo trên tạp chí Nghiên cứu Y học số 6 năm 2018 với tên "Phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến để phát hiện HPV nguy cơ thấp type 6 và 11 với độ đặc hiệu và độ nhạy cao".

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu vẫn còn một số hạn chế nhƣ: (i) độ nhạy của bộ kit chế tạo khi phối hợp cả HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp còn kém hơn so với độ nhạy của kit thƣơng mại có uy tín chỉ phát hiện HPV nguy cơ cao (HPV- Cobas® HPV Test/ Roche Diagnostic, USA; 16/18 Real-TM Quant/Sacace, Italy) hoặc nguy cơ thấp (HPV 6/11 Real-TM/Sacace, Italy). (ii) phải sử dụng 02 mix song song để phát hiện 16 type HPV mà chƣa đƣa về đƣợc 01 mix duy nhất để giảm thao tác tối đa cho kỹ thuật viên; (iii) Nghiên cứu mới đƣa ra đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV trong một phạm vi hẹp là bệnh nhân đến khám về sức khỏe sinh sản tại trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, chƣa đƣa ra đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng. Do đó, hƣớng nghiên cứu tiếp theo dự định sẽ tiến hành là:

+ Tối ƣu thêm các thành phần bổ sung vào bộ kit để tăng độ nhạy cho phản ứng và giảm xuống 01 mix để tiết kiệm hơn về sinh phẩm sử dụng và thao tác cho kỹ thuật viên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1.Dƣơng T. Thanh Hƣơng, Cao Minh Nga, Lục T. Vân Bích và cộng sự (2011), "Sự phân bố các kiểu gen HPV (Human papillomavirus) ở phụ nữ và các yếu tố liên quan", Y Học TP. Hồ Chí Minh. Tập 15.

2.Trần Văn Hợp, Lê Trung Thọ (2009), "Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội, tìm hiểu một số yếu tố liên quan", Y Hoc TP. Ho Chi Minh. Tập 13, phụ bản số 1, tr. 185 – 189

3.Cao Minh Nga, Lục Thị Vân Bích, Hồ Lê Ân, Huỳnh Ngọc Phƣơng Thảo

(2011), "Khảo sát tình hình nhiễm HPV và các kiểu gen HPV (Human

Papillomavirrus) ở phụ nữ Việt Nam trong độ tuổi từ 18 - 69 bằng kỹ thuật sinh học phân tử", Y Học TP. Hồ Chí Minh. Tập 15, Phụ bản của Số 2.

4.Nguyễn Thị Tuyết Vân, Phạm Thọ Dƣợc, Ngô Thị Tú Thủy và cộng sự

(2013), "Xác định tỷ lệ nhiễm HPV và khảo sát kiến thức, thái độ thực hành đối với

bệnh ung thƣ cổ tử cung của phụ nữ tuổi sinh sản tại Đăk Lăk năm 2013", Tạp chí y

học Dự Phịng. Tập XXV, số 8 (168) 2015 Số đặc biệt, tr. 314.

Tiếng Anh

5.Harari A. (2014), "HPV Genomics: Past, Present and Future". 45, pp. 1-18. 6.McBride A. A. (2013), "The Papillomavirus E2 Proteins", Virology. 445(0), pp. 57-79.

7.W. W. Newcomb, N. H. Olson L. M. Cowsert C. Olson Baker T. S., J. C.

Brown (1991), " Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by

cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction", Biophys. J. 60, pp. 1445-1456.

8.Monika Bergvall, Melendy, Thomas, Archambault, Jacques (2013)," The E1 proteins", Virology 445, pp.35–56.

9.Heideman D. A., Bleeker M. C., Snijders P. J. et al (2009), "Penile cancer: epidemiology, pathogenesis and prevention", World J Urol. 27(2), pp. 141-50. 10. De Flammineis. E., Brianti. P., and S. R. Mercuri (2017), "Review of HPV-

11. Snijders P.J., Brink A.A., Meijer C.J. (2007), "HPV detection methods", Dis

Markers. 23(4), pp. 273-81.

12. Bruni L., Diaz M., Castellsague X., Ferrer E. et al (2010), "Cervical human

papillomavirus prevalence in 5 continents: meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings", J Infect Dis. 202(12), pp. 1789-99.

13. Day P. M., Buck C. B., Trus B. L. (2013), "The Papillomavirus Major Capsid

Protein L1", Virology. 445(0), pp. 169-74.

14. Fisher C. (2015), "Recent Insights into the Control of Human Papillomavirus

(HPV) Genome Stability, Loss, and Degradation", J Clin Med. 4(2), pp. 204-30. 15. WHO - International agency for research on cancer (2007), "IARC Monographs

on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans - Human Papillomaviruses". 90, pp. 66-71.

16. WHO - International agency for research on cancer (2007), "IARC Monographs

on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans - Human Papillomaviruses". 90, pp. 87-112.

17. Rodriguez A. C., Castle P. E., Porras C. et al (2007), "A Comparison of

Cervical and Vaginal Human Papillomavirus", Sex Transm Dis. 34(11), pp. 849-55. 18. Engels E.A., Chaturvedi A.K., Pfeiffer R.M. et al (2011), "Human

Papillomavirus and Rising Oropharyngeal Cancer Incidence in the United States", J

Clin Oncol. 29(32), pp. 4294-301.

19. Foroni A.R., Dutra I., Couto M., Lima J., Bruges-Armas (2012), "Human

Papillomavirus and Related Diseases– From Bench to Bedside – Research Aspects", pp. 203-246.

20. Burd Eileen M. (2003), "Human Papillomavirus and Cervical Cancer",

American Society for Microbiology, pp. p. 1–17 Vol. 16.

21.Sereday K.A., Flores-Díaz E., Ferreira S. et al (2017), "HPV-6 Molecular Variants Association With the Development of Genital Warts in Men: The HIM Study", J Infect Dis. 215(4), pp. 559-565.

22. De Martel C. Forman D., Lacey C.J., Soerjomataram I. et al (2012), "Global

burden of human papillomavirus and related diseases", Vaccine. 30 Suppl 5, pp.

F12-23.

23. Lloveras B., Guimera N., Lindeman J. et al (2013), "The occasional role of

low-risk human papillomaviruses 6, 11, 42, 44, and 70 in anogenital carcinoma defined by laser capture microdissection/PCR methodology: results from a global study", Am J Surg Pathol. 37(9), pp. 1299-310.

24. Doorbar J. (2013), "The E4 protein; structure, function and patterns of

expression", Virology. 445(1-2), pp. 80-98.

25. Roman Klingelhutz A. J. (2012), "Cellular transformation by human

papillomaviruses: lessons learned by comparing high- and low-risk viruses",

Virology. 424(2), pp. 77-98.

26. Watts S.L. Krzyzek R.A., Anderson D.L. et al (1980), "Anogenital warts

contain several distinct species of human papillomavirus", Journal of Virology.

36(1), pp. 236-244.

27. Trimble C., LaCour D.E. (2012), "Human papillomavirus in infants:

transmission, prevalence, and persistence", J Pediatr Adolesc Gynecol. 25(2), pp.

93-97.

28. Lee N.W., Lee J.H., Hong S.W. and ect (2011), "Establishment of an efficient

multiplex real-time PCR assay for human papillomavirus genotyping in cervical cytology specimens: comparison with hybrid capture II", Cytopathology. 22(4), pp. 261-8.

29. Park J. S., Lee S. M., Norwitz E. R. and ect (2013), "Risk of vertical

transmission of human papillomavirus throughout pregnancy: a prospective study",

PLoS One. 8(6), pp. e66368.

30. Gorander S., Lindh M., Andersson E. et al (2007), "Real-time Taqman PCR

targeting 14 human papilloma virus types", J Clin Virol. 40(4), pp. 321-4.

31. Burd E. M. (2003), "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", Clin Microbiol Rev. 16(1), pp. 1-17.

32. Alison A., McBride (2013), " The Papillomavirus E2 proteins", Virology 445,

pp. 57–79.

33. Lee S. W., Park H., Lee I. H. et al (2012), "Rate of vertical transmission of

human papillomavirus from mothers to infants: relationship between infection rate and mode of delivery", Virol J. 9, pp. 80.

34. Nguyen T.H. Pham T.H., Herrero R. et al (2003), "Human papillomavirus

infection among women in South and North Vietnam", Int J Cancer. 104(2), pp.

213-20.

35. Grénman S. E., Rintala M. A. M., Puranen M. H. et al (2005),

"Transmission of High-Risk Human Papillomavirus (HPV) between Parents and Infant: a Prospective Study of HPV in Families in Finland", J Clin Microbiol. 43(1), pp. 376-81.

36. Munger K. Roman A. (2013), "The papillomavirus E7 proteins", Virology.

445(0), pp. 138-68.

37. Koshiol J., Rositch A. F., Hudgens M. et al (2013), "Patterns of persistent

genital human papilomavirus infection among women woldwide: a literature review and meta-analysis", Int J Cancer. 133(6), pp. 1271-85.

38. Eric J. Ryndock, Meyers Craig. (2014), "A risk for non-sexual transmission of

human papillomavirus?", Journal, pp 1165-1170.

39. Andrews E., Seaman W. T., Couch M. et al (2010), "Detection and

quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR", Virol

J. 7, pp. 194.

40. Lambert P.F., Spurgeon M.E. (2017),"Human Papillomavirus and the Stroma:

Bidirectional Crosstalk during the Virus Life Cycle and Carcinogenesis", Viruses.

9(8).

41. Paolini F. Venuti A., Nasir L., Corteggio A., Roperto S. et al (2011),

"Papillomavirus E5: the smallest oncoprotein with many functions", Mol Cancer.

42. Henley S. J., Viens L. J., Watson M. et al (2016), "Human Papillomavirus-

Associated Cancers - United States, 2008-2012", MMWR Morb Mortal Wkly Rep.

65(26), pp. 661-6.

43. Luisa Lina Villa (2009), "Laboratory Methods for Detection of Human

Papillomavirus Infection", Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

44. Jacobs M.V., Walboomers J.M., Manos M. M. et al (1999), "Human

papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide", J Pathol. 189(1), pp. 12-9.

45. Li L.J. Yang H., Xie L.X., Luo Z.Y. et al (2016), "Clinical validation of a

novel real-time human papillomavirus assay for simultaneous detection of 14 high- risk HPV type and genotyping HPV type 16 and 18 in China", Arch Virol. 161(2), pp. 449-54.

46. Chen Y., Yu D., Wu S., Wang B. et al (2012), "Simultaneous detection and

differentiation of human papillomavirus genotypes 6, 11, 16 and 18 by AllGlo quadruplex quantitative PCR", PLoS One. 7(11), pp. e48972.

47. Danny A., Milner (2015), "Diagnostic Pathology: Infectious Diseases",

Elsevier Health Sciences.

48. Nguyen V.D., Christopher V., Chu C.H et al (2016). Validation of a novel

real time PCR assay for detection of HLA-B*15:02 allele for prevention of carbamazepine-Induced Stevens-Johnson syndrome/Toxic Epidermal Necrolysis in individuals of Asian ancestry, Hum.Immunol, 77, 1140-1146.

Protocol của hãng sản xuất

49. "AccuPid HR-HPV Genotyping Kit (16, 18)". 50. "cobas® HPV Test ".

51. "HC2 High-Risk HPV ADN Test". 52. "HPV 6/11 Real-TM ".

53. "HPV 16/18 Real-TM Quant ".

Phụ lục 1: Phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu

BẢN CHẤP THUẬN

THAM GIA NGHIÊN CỨU

Dành cho ngƣời tham gia nghiên cứu

Tài liệu này đƣợc thông báo đầy đủ đến các đối tƣợng tham gia nghiên cứu, khơng có trang hay phần nào trong tài liệu này đƣợc bỏ qua. Những nội dung trong tài liệu này cần phải đƣợc giải thích rõ bằng lời với các đối tƣợng tham gia nghiên cứu.

Bản chấp thuận này dành cho bệnh nhân đến khám và điều trị phụ khoa tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, đƣợc mời tham gia nghiên cứu dựa theo các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ mà nghiên cứu đã đặt ra. Nghiên cứu này mang tên “Nghiên cứu và phát triển bộ kit phát hiện đồng thời các kiểu gen HPV nguy cơ gây ung thƣ bằng kỹ thuật multiplex real time PCR”.

THÔNG TIN DÀNH CHO BỆNH NHÂN

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu và phát triển bộ sinh phẩm sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR để phát hiện đồng thời 16 kiểu gen virus HPV nguy cơ cao và thấp phổ biến nhằm góp phần tầm soát tỷ lệ nhiễm HPV và đánh giá hiệu quả của vacxin dự phịng. Chúng tơi xin đƣa ra một số thơng tin sau đây và mời quý vị tham gia vào nghiên cứu. Quý vị có thể đồng ý/từ chối ngay hoặc quyết định sau. Chúng tôi sẽ giải đáp nếu có bất cứ câu hỏi hay thắc mắc nào.

Virus HPV là một loại virut gây u nhú của ngƣời. Đây là một trong những bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến nhất. Hơn 200 loại HPV đã đƣợc xác định dựa trên sự khác biệt về vật liệu di truyền. Các loại HPV đã đƣợc chia thành nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp theo khả năng gây ung thƣ xâm lấn. Các nghiên cứu về tiềm năng gây ung thƣ của HPV đã chứng minh rằng HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ung thƣ cổ tử cung, HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân của các bệnh lý về da và niêm mạc.

Trong nghiên cứu này, mẫu dịch phết cổ tử cung của bệnh nhân đến khám và điều trị phụ khoa tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh đƣợc thu thập để sàng lọc virus HPV bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng probe cải tiến. Bệnh nhân không bị ảnh hƣởng bởi nghiên cứu.

 Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Phụ nữ trong độ tuổi từ 18 - 65 tuổi.

 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đã cắt cổ tử cung hoàn toàn. - Bệnh nhân đang trong thời kỳ kinh nguyệt. - Bệnh nhân đang đặt thuốc.

 Sự chấp thuận của bệnh nhân là hoàn toàn tự nguyện.

 Q trình chẩn đốn và điều trị của bệnh nhân tại trung tâm không bị ảnh hƣởng khi bệnh nhân chấp nhận/ từ chối tham gia nghiên cứu.

 Bệnh nhân có quyền thay đổi quyết định kể cả có chấp nhận/ từ chối trƣớc đó.

 Kết quả đƣợc thông báo cho bệnh nhân sau khi thực hiện xét nghiệm và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Tất cả thơng tin cá nhân của bệnh nhân đƣợc bảo mật tuyệt đối.

XÁC NHẬN ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU

Tôi đã đọc thông tin nêu trên. Các câu hỏi và thắc mắc của tôi đã đƣợc nghiên cứu viên giải đáp. Tơi tình nguyện tham gia nghiên cứu này.

Họ và tên ngƣời tham gia:................................................. Chữ ký ngƣời tham gia:..................................................... Ngày (ngày/tháng/năm):.................................................... Phần dành cho nghiên cứu viên:

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán đồng thời các genotype HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR (Trang 70)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(84 trang)