STT Hóa chất Thể tích (µl)
1 DW 5,6
2 TOPreal 2X Reaction mix 12,5
3 Hỗn hợp mồi xi (10 µM) 0,5 4 Hỗn hợp mồi ngƣợc (10 µM) 0,5 5 Hồn hợp đầu dị HPV (5 µM) 0,2 6 Mồi xi ACTB (10 µM) 0,3 7 Mồi ngƣợc ACTB (10 µM) 0,3 8 Đầu dị ACTB (5 µM) 0,1
9 Khuôn ADN (plasmid tái tổ hợp) 5
Tổng thể tích: 25 µl
Phản ứng real time PCR đƣợc thực hiện trên hệ thống máy LightCycle 96 (Roche/ USA) với chu trình gia nhiệt đƣợc trình bày ở Bảng 2.9
Bảng 2.9: Chu trình nhiệt của phản ứng real time PCR như sau.
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ lặp lại
Biến tính ban đầu 95 10 phút 1
Real time PCR Gắn mồi và kéo dài 60
(Sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở cuối mỗi chu kỳ)
1 phút
45
2.2.1.4. Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật real time PCR phát hiện đồng thời các 16 type HPV và tối ưu nồng độ của chuẩn dương.
Tiến hành pha loãng plasmid để tạo dải nồng độ từ 1010
bản sao/µl đến 100 bản sao/µl. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng realtime PCR ở các dải nồng độ chứng dƣơng sau 105,104, 103, 102, 101, 1 bản sao/µl. Bổ sung 5µl ADN chuẩn dƣơng vào hỗn hợp master mix với các thành phần nhƣ Bảng 2.8 và chu trình nhiệt ở Bảng 2.9. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần (n=3). Sau khi hoàn tất các chu kỳ gia nhiệt, ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật real time PCR là số bản sao tối thiểu của chứng dƣơng trong một phản ứng mà kỹ thuật real time PCR vẫn phát hiện đƣợc.
2.2.1.5. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng
Độ đặc hiệu của phản ứng real time PCR phát hiện đồng thời 16 type HPV đƣợc đánh giá thơng qua kết quả dƣơng tính giả (nếu có) khi sử dụng khn của 9 tác nhân gây bệnh thƣờng thấy ở đƣờng sinh dục của phụ nữ bao gồm: Echerichia
coli ATCC 25922, Stapylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228, Human Simplex virus type 1-2 (HSV), cytomegalovirus (CMV),
Mycobacterium tuberculosis (MTB), Epstein-Barr virus (EBV), Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium. Các mẫu đƣợc lựa có giá trị Ct thấp nhất có thể và đạt yêu cầu Ct <32, để đảm bảo nồng độ ADN của các vi sinh vật nhiễm đƣợc sử dụng là khá cao, tối thiểu là 103 bản sao/µl.
2.2.1.6. Tạo bộ kit hồn chỉnh
Dự kiến bộ kit hồn chỉnh cung cấp đầy đủ thành phần hóa chất để thực hiện xét nghiệm định type HPV trên 48 mẫu dịch phết cổ tử cung và sẵn sàng để sử dụng. Bao gồm các thành phần sau:
Bảng 2.10: Thành phần dự kiến của bộ kit hồn chỉnh
STT Tên thành phần Hóa chất chính Quy cách Bảo quản 1 Hỗn hợp master Mix 1 - Mix (Tris-HCL pH 8.0, KCl, MgCl2, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, Taq ADN polymerase)
- Các mồi nhân bản vùng gene đặc hiệu của các type HPV 6, 16, 31, 39/68, 51, 56/66 -Các đầu dò Taqman đặc hiệu cho các type HPV 6, 16, 31, 39/68, 51, 56/66
-Các mồi nhân bản ADN IC (ACTB)
- Đầu dò Taqman đặc hiệu ADN IC (ACTB) 48 ống x 20µL -20 o C 2 Hỗn hợp master Mix 2 - Mix (Tris-HCL pH 8.0, KCl, MgCl2, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, Taq ADN polymerase)
- Các mồi nhân bản vùng gene đặc hiệu của các type HPV 11, 18, 35, 45, 58, 59, 33/52 -Các đầu dò Taqman đặc hiệu cho các type HPV 11, 18, 35, 45, 58, 59, 33/52
- Các mồi nhân bản ADN IC (ACTB)
- Đầu dò Taqman đặc hiệu ADN IC (ACTB) 48 ống x 20µL -20 o C 3 Chứng dƣơng 1 Plasmid HPV 6, 16, 31, và IC nồng độ 5×103 bản sao/µl 1 x 45µL -20 o C 4 Chứng dƣơng 2 Plasmid HPV 11,18, 33/52 và IC nng 5ì103 bn sao/àl 1 x 45µL -20 oC
5 Chứng âm Plasmid IC nng 5ì103 bn sao/àl 1 x
100 µL -20
2.2.2. Đánh giá sự tƣơng đồng của bộ kit mới chế tạo với bộ kit thƣơng mại.
Các mẫu đƣợc sử dụng để so sánh tƣơng đồng giữa các kit bao gồm: 20 mẫu ADN đã đƣợc xác định âm tính với 16 type HPV trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng và Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng; 30 mẫu ADN đã đƣợc xác định dƣơng tính gồm 25 mẫu đã đƣợc xác định dƣơng tính với các type HPV nguy cơ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đƣợc xác định bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test của hãng Roche - USA và 5 mẫu dƣơng tính với HPV nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định bằng HPV 6/11 Real-TM của hãng Sacace - Italy. Kít Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) và HPV 6/11 Real-TM (Sacace - Italy) là hai kit đã đƣợc cấp chứng nhận IVD. Kít Cobas®HPV test đã đƣợc FDA chấp thuận cho sàng lọc tầm soát ung thƣ cổ tử cung.
Tiến hành thực hiện phản ứng real time PCR với bộ kit mới nghiên cứu trên các mẫu đã đƣợc chẩn đốn âm tính và dƣơng tính với hai kít thƣơng mại trên để đánh giá độ tƣơng đồng về khả năng phát hiện chính xác sự có mặt của các type HPV. Kết quả so sánh đƣợc chuyển thành Bảng 2.11.
Bảng 2.11. So sánh sự tương đồng giữa kit trong nghiên cứu và kit thương mại
Kit trong nghiên cứu (Dƣơng tính)
Kit trong nghiên cứu (Âm tính)
Tổng số
Kit thƣơng mại
(Dƣơng tính) a b a+b
Kít thƣơng mại
(Âm tính) c d c+d
Tổng số a+c b+d a+b+c+d
Tiến hành đánh giá sự tƣơng đồng giữa kit trong nghiên cứu với kit thƣơng mại thông qua hệ số phù hợp Kappa theo cơng thức:
Trong đó:
- OA: Observed Agreement: Phù hợp quan sát. Đƣợc tính theo cơng thức
- EA: Expected Agreement: Phù hợp tính tốn
2.2.3. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu bệnh nhân mẫu bệnh nhân
100 mẫu tăm bông phết dịch cổ tử cung trên những phụ nữ có biểu hiện bệnh lý về phụ khoa, đƣợc bảo quản trong dung dịch nƣớc muối sinh lý đã khử trùng và đƣợc sử dụng ngay để tách chiết ADN tổng số. ADN đƣợc sử dụng ngay cho phản ứng real time PCR hoặc đƣợc bảo quản ở -80oC. Mẫu đƣợc thu thập theo phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện, tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh từ năm 2017 đến 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân là phụ nữ từ 18 - 65 tuổi, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên cứu; Tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời kỳ kinh nguyệt và đang đặt thuốc. Bệnh nhân đƣợc cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên cứu, đƣợc bảo mật thông tin cá nhân và ký vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu.
Tách chiết ADN của HPV từ dịch phết cổ tử cung đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn bộ kit ANAPURE VIRAL ADN/ARN KIT (ANABIO R&D, Việt Nam). Quy trình bao gồm:
- Bƣớc 1: Thêm 400 µL VLB vào 200 µL mẫu dịch phết cổ tử cung. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Bƣớc 2: Thêm 40 µL proteinase K. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần. Ủ mẫu ở 70º trong 15 phút.
- Bƣớc 3: Bổ sung 150 µL isopropanol vào ống ở bƣớc 2. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần.
- Bƣớc 4: Chuyển mẫu ở bƣớc 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trên ống thu dịch SC01 (ANAPURE collection tube).
- Bƣớc 5: Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.
- Bƣớc 6: Thêm 500 µL WB1 vào cột lọc SC01. Lặp lại bƣớc 5.
- Bƣớc 7: Thêm 500 µL WB2 vào cột lọc SC01. Lặp lại bƣớc 5. Ly tâm khô ở tốc độ 12.000 rpm trong 4 phút.
- Bƣớc 8: Chuyền cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50-200 µL EB vào trung tâm cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút và ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút để thu ADN tách đƣợc.
Tiến hành phản ứng real time PCR với phƣơng pháp mới xây dựng trong nghiên cứu để đánh giá tỷ lệ nhiễm HPV trên phụ nữ đến khám tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh trong năm 2017-2018.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm nguy cơ cao phổ biến và 2 nhóm nguy cơ thấp bằng kỹ thuật multiplex nhóm nguy cơ cao phổ biến và 2 nhóm nguy cơ thấp bằng kỹ thuật multiplex real time PCR.
3.1.1. Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích.
Sau khi chọn đƣợc các cặp mồi đặc hiệu cho nhân bản trình tự gen đích HPV và tối ƣu các điều kiện phản ứng. Các mẫu ADN xác định thuộc các chủng đang nghiên cứu đƣợc dùng làm khn cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự đích, điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% thu đƣợc kết quả trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự của 16 type HPV bằng cặp mồi đặc hiệu
Giếng 1-14: HPV6 E6-7 165bp, HPV11 L1 174bp, HPV16 E6 128bp, HPV18 E6 124bp, HPV31 E6 130bp, HPV33/52 L1 87bp, HPV35 E6-7 78bp, HPV39/68 E1 128 bp, HPV45 E6-7 148bp, HPV51 L1 77bp, HPV56/66 E6-7 88bp, HPV58 E6-7
97bp, HPV59 E6 136bp; giếng 14: ACTB; M: thang chuẩn 100 bp.
Quan sát thấy trên hình ảnh điện di cho thấy cả 14 giếng chỉ có 1 băng duy nhất, sáng, rõ nét, khơng có băng phụ, so sánh với thang chuẩn có các kích thƣớc mong đợi. Do đó, có thể kết luận phản ứng PCR đã khuếch đại thành công các sản phẩm mong muốn, cặp mồi có độ đặc hiệu cao, thành phần và chu trình của phản
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 100 200 300 500 1000 bp
ứng PCR thiết kế là phù hợp. Sản phẩm khuếch đại này đƣợc sử dụng cho bƣớc nhân dịng tiếp theo.
3.1.2. Nhân dịng trình tự đích tạo chứng dƣơng.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ đƣợc tiến hành chèn vào trong vector pTOP T/A V2 sử dụng tế bào dòng khả biến E.coli XL10-GOLD sử dụng bộ kit
TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics), sau đó ni cấy trên mơi trƣờng LB đặc có bổ sung Ampicillin/X-gal/IPTG, tiến hành chọn lọc khuẩn lạc sau 18 tiếng. Kết quả hình ảnh đại diện của khuẩn lạc HPV 6 sau ni cấy đƣợc thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2: Hình ảnh kết quả khuẩn lạc E.coli mang đoạn gen HPV
Khuẩn lạc màu trắng là khuẩn lạc có mang đoạn chèn, khuẩn lạc màu xanh là khuẩn lạc không mang đoạn chèn.
Kiểm tra kết quả nhân dòng gen bằng phản ứng clony-PCR các khuẩn lạc sau khi nuôi cấy với cặp mồi vector (M13 - cung cấp kèm theo kit), sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.3:
Hình 3.3. Ảnh điện di kiểm tra kết quả nhân dịng trình tự đích bằng mồi vector
Giếng 1-14: HPV6 E6-7 367bp , HPV11 L1 376bp, HPV16 E6 330bp, HPV18 E6 326bp, HPV31 E6 332bp, HPV33/52 L1 289bp, HPV35 E6-7 280bp, HPV39/68 E1 330bp, HPV45 E6-7 350bp, HPV51 L1 279bp, HPV56/66 E6-7 290bp, HPV58 E6-7
299bp, HPV59 E6 338bp; giếng 14: ACTB; M: thang chuẩn 100 bp
Để khẳng định chắc chắn các plasmid tái tổ hợp mang trình tự gen đích đặc hiệu cho các type HPV, sản phẩm PCR với cặp mồi vector cho kết quả dƣơng tính với các băng có kích thƣớc mong muốn đƣợc tinh sạch và đem gửi giải trình tự xác định dựa theo phƣơng pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi Cơng ty 1st base (Singapore). Kết quả giải trình tự (Phụ lục 3) đƣợc phân tích bằng phần mềm
SnapGen và so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả giải trình tự cho thấy đã nhân dịng chính xác vùng trình tự gen đặc hiệu của các type HPV.
3.1.3. Xác định tính đặc hiệu của mồi và đầu dò trong phản ứng real time PCR.
Dựa vào kích thƣớc hay trọng lƣợng phân tử và nồng độ của ADN plasmid tái tổ hợp thu nhận đƣợc, chúng tơi đã tính đƣợc số bản sao của các plasmid. Tiến hành pha loãng plasmid để tạo dải nồng độ từ 1010 bản sao/µl đến 1 bản sao/µl. Bổ sung 5µl ADN plasmid nồng độ 105 bản sao/µl vào từng hỗn hợp master mix đơn cặp mồi/đầu dò, 13 cặp mồi/đầu dò với các thành phần nhƣ Bảng 2.6, Bảng 2.8 và chu
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 100 200 300 500 1000 bp
trình nhiệt ở Bảng 2.9 để xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi/đầu dị. Sau khi hoàn tất các chu kỳ gia nhiệt, kết quả cho thấy các tín hiệu FAM đặc hiệu cho HPV 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 66, 68, HEX đặc hiệu cho HPV 6,11, Cy5 cho HPV 16,18 và tín hiệu Texas cho ACTB lên rõ nét, tín hiệu huỳnh quang thu nhận đƣợc tốt cho thấy các cặp mồi/đầu dò đặc hiệu đối với các tác nhân trong phản ứng.
A.1. HPV 6 đơn cặp - HEX A.2. HPV 6 đa cặp - HEX
B.1. HPV 11 đơn cặp - HEX B.2. HPV 11 đa cặp - HEX
C.1. HPV 16 đơn cặp - Cy5 C.2. HPV 16 đa cặp - Cy5
E. 1. HPV 31 đơn cặp - FAM E.2. HPV 31 đa cặp - FAM
F.1. HPV 33/52 đơn cặp - FAM F.2. HPV 33/52 đa cặp - FAM
Hình 3.4. Đường tín hiệu huỳnh quang kiểm tra tính đặc hiệu của mồi và đầu dị trong phản ứng.
(A.1, A.2): HPV 6 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dò; (B.1, B.2): HPV 11 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dò, (C.1, C.2): HPV 16 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dò;
(D.1, D.2): HPV 18 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dò; (E.1, E.2): HPV 31 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dò; (F.1, F.2): HPV 33/52 đơn cặp và đa cặp mồi và đầu dị
Kết quả thể hiện trong Hình 3.4 và Bảng 3.1 cho thấy, so sánh khi thực hiện phản ứng real time PCR đơn cặp mồi và đầu dò với phản ứng real time PCR với 13 cặp mồi và đầu dị cho kết quả tƣơng đồng. Mặc dù tín hiệu huỳnh quang có giảm khoảng 2-3 lần ở một số type HPV high risk khi thực hiện phản ứng multiplex real time PCR do sự phối hợp của nhiều type dẫn đến tín hiệu nền cao qua đó ảnh hƣởng đến tín hiệu đọc của máy. Tuy vậy, tín hiệu huỳnh quang vẫn cao hơn đáng kể, gấp 8 lần tín hiệu nền và khơng có phản ứng chéo giữa các cặp mồi và đầu dò gây nên hiện tƣợng dƣơng tính giả (Hình 3.4). Bên cạnh đó, giá trị Ct không lệch nhau quá 1 giá trị. Kết quả cụ thể về giá trị Ct đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi và đầu dị trong phản ứng
STT Kiểu gen
Đơn mồi và đầu dò Phối hợp 13 cặp mồi và đầu dò
Ct HEX Ct FAM Ct Cy5 Ct Texas Ct HEX Ct FAM Ct Cy5 Ct Texas 1 6 22,95 - - - 22,99 - - - 2 11 22,67 - - - 23,01 - - - 3 16 - - 23,56 - - - 24,02 - 4 18 - - 22,14 - - - 22,54 - 5 31 - 23,95 - - - 23,98 - - 6 33/52 - 21,61 - - - 21,76 - - 7 35 - 24,15 - - - 24,66 - - 8 39/68 - 22,35 - - - 22,67 - - 9 45 - 25,61 - - - 25,35 - - 10 51 - 24,92 - - - 24,99 - - 11 56/66 - 22,19 - - - 22,59 - - 12 58 - 23,88 - - - 24,01 - - 13 59 - 23,76 - - - 23,87 - - 14 ACTB - - - 22,14 - - - 22,55
3.1.4. Xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng và tối ƣu nồng độ của chuẩn dƣơng. dƣơng.
Xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng real time PCR ở các dải nồng độ plasmid sau: 105, 104, 103, 102, 101, 1 bản sao/µl. Bổ sung 5µl ADN plasmid vào hỗn hợp master mix với các thành phần nhƣ Bảng 2.8 và chu trình nhiệt ở Bảng 2.9 với n=3. Sau khi hoàn tất các chu kỳ gia nhiệt, ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật real time PCR là số bản sao tối thiểu của chứng dƣơng trong một phản ứng mà kỹ thuật