CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm
3.1.2. Nhân dịng trình tự đích tạo chứng dƣơng
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ đƣợc tiến hành chèn vào trong vector pTOP T/A V2 sử dụng tế bào dòng khả biến E.coli XL10-GOLD sử dụng bộ kit
TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics), sau đó ni cấy trên mơi trƣờng LB đặc có bổ sung Ampicillin/X-gal/IPTG, tiến hành chọn lọc khuẩn lạc sau 18 tiếng. Kết quả hình ảnh đại diện của khuẩn lạc HPV 6 sau nuôi cấy đƣợc thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2: Hình ảnh kết quả khuẩn lạc E.coli mang đoạn gen HPV
Khuẩn lạc màu trắng là khuẩn lạc có mang đoạn chèn, khuẩn lạc màu xanh là khuẩn lạc không mang đoạn chèn.
Kiểm tra kết quả nhân dòng gen bằng phản ứng clony-PCR các khuẩn lạc sau khi nuôi cấy với cặp mồi vector (M13 - cung cấp kèm theo kit), sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.3:
Hình 3.3. Ảnh điện di kiểm tra kết quả nhân dịng trình tự đích bằng mồi vector
Giếng 1-14: HPV6 E6-7 367bp , HPV11 L1 376bp, HPV16 E6 330bp, HPV18 E6 326bp, HPV31 E6 332bp, HPV33/52 L1 289bp, HPV35 E6-7 280bp, HPV39/68 E1 330bp, HPV45 E6-7 350bp, HPV51 L1 279bp, HPV56/66 E6-7 290bp, HPV58 E6-7
299bp, HPV59 E6 338bp; giếng 14: ACTB; M: thang chuẩn 100 bp
Để khẳng định chắc chắn các plasmid tái tổ hợp mang trình tự gen đích đặc hiệu cho các type HPV, sản phẩm PCR với cặp mồi vector cho kết quả dƣơng tính với các băng có kích thƣớc mong muốn đƣợc tinh sạch và đem gửi giải trình tự xác định dựa theo phƣơng pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi Cơng ty 1st base (Singapore). Kết quả giải trình tự (Phụ lục 3) đƣợc phân tích bằng phần mềm
SnapGen và so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả giải trình tự cho thấy đã nhân dịng chính xác vùng trình tự gen đặc hiệu của các type HPV.