STT Các thành phần của phản ứng Thể tích (µL)
1 Nƣớc khử ion 11,8
2 Đệm nTaq 10X 2
3 Hỗn hợp dNTPs (2 mM) 2
4 Mồi xuôi của vector (10 µM) 1 5 Mồi ngƣợc của vector (10 µM) 1
6 n-Taq (5 unit/µL) 0,2
7 ADN plasmid 2
Tổng thể tích phản ứng 20
Nồng độ của ADN plasmid mang đoạn chèn sau tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A260) trên máy NanoDrop. Trƣớc tiên 1µl đệm dùng để chiết ADN/plasmid trong quá trình tách chiết và tinh sạch (có thể là H2O hoặc TE) đƣợc sử dụng để đƣa giá trị A260 của máy về giá trị zero trƣớc khi đo mẫu. Mẫu ADN đƣợc trộn đều, 1 µl mẫu đƣợc sử dụng để đo A260. Việc đo đƣợc lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
Dựa vào nồng độ ADN plasmid từ đó tính đƣợc số bản sao của plasmid theo công thức:
A=(X*6.0221*1023)/(N*660*109) Trong đó: A: Số bản copy của plasmid trong 1 đơn vị thể tích
X: Khối lƣợng của plasmid trong đơn vị thể tích cần tính. N: Chiều dài của plasmid mang đoạn chèn.
Chứng dƣơng là hỗn hợp của các plasmid mang đoạn chèn đại diện cho từng kênh màu thuộc 2 ống master mix khác nhau và gen nội chuẩn ACTB, do đó ln đƣợc nhận biết khi có mặt trong phản ứng real time PCR.
2.2.1.3. Xác định tính đặc hiệu của mồi và đầu dò trong phản ứng real time PCR
Xác định tính đặc hiệu của mồi và đầu dị bao gồm hai bƣớc sau:
(1): Thực hiện phản ứng real time PCR đơn cặp mồi và đầu dò: từng cặp mồi và đầu dò riêng lẻ.
(2): Thực hiện phản ứng real time PCR đa cặp mồi và đầu dò: trộn 13 cặp mồi và đầu dò.
Thành phần nồng độ tƣơng ứng của phản ứng real time PCR đơn cặp mồi và đầu dị đƣợc trình bày ở Bảng 2.6.
Sau khi thực hiện phản ứng real time PCR đa cặp mồi và đầu dò với sự phối hợp giữa các nhóm mồi và đầu dị khác nhau, chúng tôi đƣa ra đƣợc cách thiết kế phản ứng real time PCR đa cặp mồi và đầu dò đƣợc chia thành 2 ống phản ứng với thành phần ở Bảng 2.7, thành phần và nồng độ tƣơng ứng của phản ứng real time PCR đa cặp mồi và đầu dò ở Bảng 2.8