- Môi trƣờng xác đ nh khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm: Nutrient agar 0,1% cơ chất collagen.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phục hồi 67 chủng vi nấm có khả năng sinh enzyme phân huỷ cơ chất collagen đang bảo quản lạnh sâu theo phƣơng pháp của Smith & Onions (1994) [7]. Làm tan băng nhanh và cấy vào môi trƣờng Malt extract agar.
- Đánh giá độ phục hồi của vi nấm theo phƣơng pháp F.P.Simione, M.S & EM. rown, .S.(1991): có 6 mức độ phục hồi là rất tốt, tốt, khá, trung bình, yếu, khơng sống sót.
2.3.2. Phương pháp kiểm tra mức độ thuần khiết các chủng vi nấm sau phục
hồi trên kính hiển vi quang học
Đặc điểm hình thái vi nấm là cơ sở để phân loại vi nấm. Mặc d nhiều phƣơng pháp phân loại vi nấm đã đƣợc nghiên cứu, ứng dụng nhƣng phƣơng pháp hình thái h c vẫn là tiêu chuẩn vàng cho chẩn đốn vi nấm.
Các đặc điểm hình thái đặc trƣng cần quan sát:
- Đặc điểm của sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay khơng có vách ngăn. - Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản.
- Đặc điểm của bào tử: Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp…
Các bƣớc thực hiện xác đ nh đặc điểm hình thái vi nấm gồm: làm tiêu bản; quan sát trên kính hiển vi; vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm, dựa vào khóa phân loại xác đ nh tên lồi.
* Làm tiêu bản
- Làm tiêu bản khơng nhuộm: Lấy một ít sợi nấm và cơ quan sinh sản trên mặt thạch bằng que cấy, đặt lên lam kính đã hơ nóng làm sạch dầu. Đậy lamen ép nhẹ cho ổn đ nh sợi nấm.
- Làm tiêu bản nhuộm xanh metylen: Làm tƣơng tự trên, khi đậy lamen trƣớc khi ép thì nhỏ 1-2 gi t xanh metylen vào góc lam kính cho thấm vào sợi nấm, ép
nhẹ lamen. Lấy xanh metylen thừa bằng giấy thấm. Có thể nhỏ thuốc nhuộm trƣớc, lấy sợi nấm và cơ quan sinh sản sau.
* Quan sát trên kính hiển vi
- Đƣa tiêu bản vào v trí, quan sát lần lƣợt ở các vật kính nhƣ trong quy trình sử dụng kính hiển vi.
- Xác đ nh các đặc điểm của sợi nấm, cơ quan sinh sản, bào tử. Sử dụng thƣớc đo trong kính để xác đ nh kích thƣớc các cơ quan sinh sản, bào tử.
* Vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm
Một số đặc điểm cần lƣu ý ghi chép, vẽ hình làm cơ sở cho phân loại vi nấm dựa trên các khóa phân loại về hình thái:
- ào tử: v trí, hình dạng, kích thƣớc, cách sắp xếp…
Đặc điểm hình dạng của bào tử có khi rất đặc biệt: elip, cầu, dài, giống hạt hay quả nào đó, nhiều loại hình dạng thay đổi khi bào tử cịn non tới khi già; bề mặt bào tử có rãnh, rãnh nơng hay sâu, v trí rãnh ở trung tâm hay lệch; phẳng hay có gai, gai dày hay thƣa, đều hay không đều, gai nh n hay t , bẹt dạng vảy…
Đặc điểm sắp xếp của bào tử: rời rạc hay nối tiếp; nối tiếp nhau thành chuỗi, dài, ngắn, giữa các bào tử kế tiếp có tạo đế hay khớp nối khơng, khớp nối dạng gì, có gì liên kết giữa các bào tử...
Kích thƣớc các chiều ngang, dài; kích thƣớc các đặc điểm khác của bào tử (nếu cần).
- Cuống sinh bào tử: Sinh ra từ đâu, thân sợi nấm hay đầu khí sinh, có tạo b ng khơng, hình dạng ra sao, kích thƣớc, màu sắc, thành trơn hay x xì...
- Thể bình: Hình dạng có là thể hình trụ, trái xoan, chóp, thót…; kích thƣớc dài, rộng bao nhiêu; số lƣợng dày hay thƣa; tạo vòng hay tạo cụm; một hay hai tầng; màu sắc của thể bình; kích thƣớc, màu sắc của cuống thể bình.
Ngồi ghi chép các đặc điểm vi thể, cần ghi các đặc điểm của khuẩn lạc: hình dạng, màu sắc, tốc độ phát triển, có tạo hạch nấm, thể quả, chất tiết khơng… Nếu có điều kiện, xác đ nh các đặc điểm siêu vi thể của bào tử, thể bình, cuống sinh bào tử, sợi nấm để đ nh danh thêm chính xác, rõ ràng.
2.3.3. Phương pháp làm mẫu nấm nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV
* Chuẩn bị:
- Chuẩn b mẫu: mẫu đã đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch hoặc trong ống nghiệm thời gian 7-10 ngày, bề mặt mẫu cần khơ thống, tránh ẩm ƣớt.
- Chuẩn b dụng cụ và hóa chất:
+ Đế làm mẫu: sử dụng đế hình trụ trịn (chun dụng với kính SEM) đƣờng kính 8 mm, cao 1 cm, một đầu dán dăng dính cacbon 2 mặt và cắt viền băng dính cho vừa vặn bề mặt đế, một đầu ghi kí hiệu hoặc tên mẫu bằng bút dạ.
+ Một cốc thủy tinh thể tích 50 ml
+ Một đĩa petri, dán băng dính 2 mặt kích thƣớc khoảng 4x4 cm lên chính giữa mặt trong đĩa.
* Tiến hành:
- Dính mẫu lên mặt băng dính cacbon:
+ Tay trái cầm đĩa petri bằng 5 ngón tay, mặt đĩa song song lịng bàn tay, mặt thạch có mẫu hƣớng ra ngồi, tay phải cầm đế, mặt băng dính các bon hƣớng ra ngồi.
+ Ấn mặt đế băng dính cacbon vào bề mặt mẫu trên đĩa thạch, một lực vừa đủ để có thể thu đƣợc cấu trúc nấm cần soi (ấn quá mạnh thì bào tử hoặc sợi nấm sẽ b dập nát hoặc cấu trúc nấm chồng lên nhau gây khó quan sát).
- Cố đ nh mẫu bằng hơi Osmic:
+ Dính mặt đế khơng có băng dính cacbon lên băng dính 2 mặt trên đĩa petri (có thể dính nhiều đế trong một lần).
+ Dùng pipet hút khoảng 2 ml dung d ch osmic 2% trong nƣớc cho vào cốc thủy tinh.
+ Úp đĩa petri có dính mẫu lên cốc thủy tinh có osmic, sau đó để trong tủ hút cho osmic bay hơi, thời gian 2 giờ.
- Mạ phủ mẫu: bằng máy mạ phủ vàng JFC 1200 của hãng JEOL, thời gian mạ 60 giây.
- Soi mẫu: bằng kính HVĐT quét JSM-5410LV của hãng JEOL, chụp ảnh trên máy tính bằng phền mềm Sem Afore.
2.3.4. Tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase theo phương pháp của Laster Hankin, S.L. Anagnistakis,(1975) với các chủng sống sót [7]:
- Chuẩn b các đĩa mơi trƣờng Nutrien agar (Mecrk) có 0,1% collagen (hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C; pH = 7,0 ± 0,2).
- Cấy vi nấm trên đĩa môi trƣờng đặc thành 3 điểm. Để đĩa môi trƣờng ở 250C/5 ngày trong tủ nuôi cấy vi sinh vật inder (Đức). Mỗi chủng vi nấm cấy 3 đĩa (3 lần).
- Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số
phân giải cơ chất với từng chủng vi nấm theo công thức: I = R22/R12 Trong đó: R2 là bán kính vịng phân giải, mm.
R1 là bán kính kính khuẩn lạc, mm.
Hệ số phân giải I thể hiện khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính enzyme của vi nấm. Hệ số I càng cao thì khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase càng lớn.
- Căn cứ vào thành phần, số lƣợng các chi, lồi vi nấm sống sót để lựa ch n 15 chủng vi nấm đại diện, có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase tốt nhất.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu xác định một số điều kiện môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
2.3.5.1. Nghiên cứu xác định các giá trị pH ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
Nghiên cứu các giá tr pH: 8,0; 8,5; 9,0 ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm (hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C). Các bƣớc tiến hành:
Tạo các đĩa mơi trƣờng ni cấy có các giá tr pH khác nhau: môi trƣờng Nutrient agar (Mecrk), collagen 0,1%; pH điều chỉnh bằng NaOH 1M và HCl 1M.
Cấy các chủng vi nấm nghiên cứu trên các đĩa mơi trƣờng có giá tr pH khác nhau ở trên. Nuôi cấy ở 250C trong tủ nuôi cấy vi sinh vật inder (Đức).
- Xác đ nh pH ức chế khả năng phát triển, khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm nghiên cứu:
+ Theo dõi và đo đƣờng kính khuẩn lạc vi nấm sau 3, 5 ngày. Nếu vi nấm không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn khơng có khuẩn lạc vi nấm xuất hiện, kết luận pH ức chế vi nấm m c tới ngày thứ 30.
+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số phân giải cơ chất (IpH). Nếu khơng có vịng phân giải, có thể kết luận ở pH đó đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm.
2.3.5.2. Nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
Nghiên cứu các giá tr nhiệt độ: 140C, 160C, 180C ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm (hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; pH = 7,0 ± 0,2; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%). Các bƣớc tiến hành:
- Tạo các đĩa môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng Nutrient agar (Mecrk), có collagen 0,1% hấp vô tr ng ở 1210
C/15 phút.
- Cấy các chủng vi nấm nghiên cứu trên đĩa môi trƣờng đặc. Ni cấy ở tủ vi khí hậu RUMED (Đức) với các dải nhiệt độ nghiên cứu.
- Xác đ nh nhiệt độ ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm nghiên cứu:
+ Theo dõi và đo đƣờng kính khuẩn lạc vi nấm sau 3, 5 ngày. Nếu vi nấm không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn khơng có khuẩn lạc vi nấm xuất hiện, kết luận nhiệt độ ức chế vi nấm m c tới ngày thứ 30.
+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số phân giải cơ chất (Inđ). Nếu khơng có vịng phân giải, có thể kết luận ở nhiệt độ đó đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm.
2.3.5.3. Nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước môi trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
Nghiên cứu các giá tr hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy: 0,60aw; 0,65aw; 0,70aw ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm (pH = 7,0 ± 0,2; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250
C ± 20C). Các bƣớc tiến hành:
- Tạo mơi trƣờng ni cấy có hoạt độ nƣớc nghiên cứu theo phƣơng pháp Dallyn-Fox (1980): môi trƣờng Nutrient agar (Merck) có collagen 0,1%, hấp vô tr ng ở 1210C/15 phút.
- Cấy các chủng vi nấm nghiên cứu trên đĩa môi trƣờng đặc. Nuôi cấy ở 250C trong tủ nuôi cấy vi sinh vật inder.
- Xác đ nh hoạt độ nƣớc ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm nghiên cứu:
+ Theo dõi và đo đƣờng kính khuẩn lạc vi nấm sau 3, 5 ngày. Nếu vi nấm không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn khơng có khuẩn lạc xuất hiện, kết luận hoạt độ nƣớc ức chế vi nấm m c tới ngày thứ 30.
+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số phân giải cơ chất (Ihđ). Nếu khơng có vịng phân giải, có thể kết luận hoạt độ nƣớc
2.3.5.4. Nghiên cứu xác định các giá trị độ ẩm khơng khí ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
Nghiên cứu các giá tr độ ẩm mơi trƣờng khơng khí: RH = 60%; 70%; 80% ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm (hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; pH = 7,0 ± 0,2; nhiệt độ = 250C ± 20C).
Các bƣớc tiến hành:
- Tạo môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng nutrient agar (Merck) có collagen 0,1%, hấp vơ tr ng ở 1210C/15 phút.
- Cấy các chủng vi nấm nghiên cứu trên đĩa môi trƣờng đặc. Nuôi cấy ở 250C, trong tủ vi khí hậu RUMED (Đức), điều chỉnh các độ ẩm mơi trƣờng khơng khí nghiên cứu theo quy trình vận hành máy.
- Xác đ nh độ ẩm không khí ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm nghiên cứu:
+ Theo dõi và đo đƣờng kính khuẩn lạc vi nấm sau 3, 5 ngày. Nếu vi nấm không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn khơng có khuẩn lạc xuất hiện, kết luận độ ẩm khơng khí ức chế vi nấm m c tới ngày thứ 30.
+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số phân giải cơ chất (Iđa). Nếu khơng có vịng phân giải, có thể kết luận độ ẩm khơng khí đó đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm.
2.3.5.5. Nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
Nghiên cứu với tổ hợp các điều kiện sau: nhiệt độ = 160C ± 0,20C; RH = 70% ± 3%; pH = 8,5 ± 0,1; aw = 0,65 ± 0,01.
Các bƣớc tiến hành:
- Tạo môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng nutrient agar (Merck) có collagen 0,1%, đƣợc chỉnh pH = 8,5 bằng NaOH và HCl, chỉnh aw = 0,65 theo phƣơng pháp
Dallyn-Fox (1980), hấp vô tr ng ở 1210C/15 phút. Đo và chỉnh lại pH = 8,5 sau hấp vô tr ng trong tủ an toàn sinh h c.
- Cấy các chủng vi nấm nghiên cứu trên đĩa môi trƣờng đặc. Nuôi cấy ở 160C, trong tủ vi khí hậu RUMED (Đức), điều chỉnh độ ẩm mơi trƣờng khơng khí 70% theo quy trình vận hành máy.
- Xác đ nh khả năng ức chế sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm nghiên cứu:
+ Theo dõi và đo đƣờng kính khuẩn lạc vi nấm sau 3, 5 ngày. Nếu vi nấm không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn khơng có khuẩn lạc xuất hiện, kết luận tổ hợp các điều kiện môi trƣờng đã ức chế vi nấm m c tới ngày thứ 30.
+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl2. Tính hệ số phân giải cơ chất (Ith). Nếu khơng có vịng phân giải, có thể kết luận tổ hợp điều kiện môi trƣờng đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm.
2.3.6. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Tổng hợp và xử lý số liệu theo phƣơng pháp thống kê (sử dụng Excel 2003 trong tính tốn, phân tích).
Chƣơng 3