Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat trên dịng cây đối chứng và dòng cây RBC1
1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy
phản ứng
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, các cơng trình nghiên cứu về sự oxy hóa Met bởi ROS trên các phân tử MRP và quá trình sửa chữa bởi enzyme Msr đã được thực hiện khá công phu. Từ năm 1989, Reddy và cs đã chỉ ra α-2-macroglobulin đóng vai trị như chất ức chế protease và hoạt động tại những vị trí sưng tấy, nơi có khả năng bị tấn cơng cao bởi ROS. Tại đó, mỗi tiểu phần của α-2-macroglobulin có khả năng thu dọn ít nhất 10 mole chất oxy hóa với lượng tương ứng chuyển hóa Met thành MetO. Nhưng nếu cứ tiếp tục phải đối mặt với các tác nhân oxy hóa, tryptophan sẽ bị chịu tác dụng của ROS, dẫn đến bất hoạt α-2-macroglobulin [68]. Năm 2002, Gustavsson và cs đã gây sốc nhiệt nhẹ protein Hsp21 nằm trong lục lạp. Kết quả là protein này bị bất hoạt do các Met trên bề mặt phân tử chuyển hóa thành MetO. Cuối cùng, protein lại được hoạt hóa do tác dụng của Msr làm giảm lượng MetO [37].
Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng được ghi nhận [18, 28, 46]. Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật [81]. Mối liên quan giữa q trình oxy hóa Met với sự mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin [26] và sự mất chức năng của protein này [26, 46, 78] cũng được ghi nhận.
Việc phát hiện một cách có hệ thống các protein có Met mẫn cảm với tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met cũng như sửa chữa bởi Msr đã được rất nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu. Các phương pháp xác định bao gồm khối phổ, sửa đổi các gốc Met và MetO kết hợp với phân tích axit amin, dựa vào phân tích phóng xạ, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp miễn dịch sử dụng các kháng thể đặc hiệu với các dạng MetO [26].
Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung
tính (neutrophil). Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với đầu dị ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ. Peptide được phát hiện tăng 16 Da [71]. Đây là kết quả của q trình oxy hóa Met thành MetO. Nhóm tác giả đã phát hiện có khoảng 10-50% các gốc Met trong protein E.coli bị oxy hóa khi tiếp xúc với HOCl hoặc bạch cầu phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm. Protein nằm ở vỏ tế bào có mức độ mẫn cảm cao đối với sự oxy hóa Met, trong khi Met gắn trên các protein thuộc tế bào chất và nội màng hầu như khơng bị oxy hóa [71]. Điều này cho thấy các protein nội bào được bảo vệ trước tác dụng của HOCl. Tuy nhiên, đáng tiếc rằng nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hồn chỉnh các protein và vị trí các gốc Met bị mẫn cảm với q trình oxy hóa.
Shechter và cs đã sử dụng phương pháp sửa đổi bằng hóa học để xác định các gốc MetO khi vẫn có mặt gốc Met trong phân tử protein. Protein đã bị oxy hóa được xử lý với cyanogen bromide trong điều kiện 80% axit formic. Phản ứng của protein có chứa Met với cyanogen bromide làm đứt liên kết peptide tại vị trí carboxyl của phân tử Met. Phản ứng này làm đứt các liên kết peptide trong chuỗi peptide một cách có định hướng. Sau khi xử lý, các gốc Met sẽ bị chuyển hóa thành homoserine cịn gốc MetO được giữ nguyên. Mẫu protein lại tiếp tục được đông khô và thủy phân trong mơi trường HCl 6N có chứa dithioerythritol để tồn bộ MetO sẽ bị khử để trở về dạng Met (trên 95% tổng số lượng MetO sẽ bị chuyển hóa). Cuối cùng, homoserine và Met sẽ được đo bằng phương pháp phân tích axit amin, tương ứng với hàm lượng Met và MetO để chỉ ra tổng số gốc Met mẫn cảm với q trình oxy hóa của protein [75]. Tuy nhiên, phương pháp này khơng sử dụng được để phân tích axit amin tự do.
Năm 2008, Le và cs đã rất nỗ lực khi nghiên cứu sự oxy hóa Met và sự khử MetO thơng qua việc sử dụng protein có Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa. Nhóm tác giả đã thành công khi phân lập và biểu hiện ba MRP và phát triển các phương pháp kiểm tra q trình oxy hóa Met và khử MetO thơng qua điện di protein SDS-PAGE và tạo kháng thể nhận biết MetO nhờ kỹ thuật lai miễn dịch [53]. Le và cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật [52]. Bên cạnh
đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu q trình oxy hóa Met và q trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr [57]. Thông qua đó, natri hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP.
Gần đây, Tarrago và cs đã sử dụng sắc ký ái lực như là một cách tiếp cận để dị tìm các protein là cơ chất (đích tác động) của Msr mà cụ thể là AtMsrB1. Kết quả đã chỉ ra 24 protein có vai trị trong q trình quang hợp, dịch mã và tham gia vào quá trình bảo vệ cây chống lại những bất lợi về oxy hóa cũng như có vai trị trong q trình sinh tổng hợp đường và các axit amin. Bên cạnh đó, đa số đích tác động của MsrB1 là các protein chứa hàm lượng cao Met [84]. Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mơ hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa [45]. Sử dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả đã tìm
thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại. Catalase 2 là enzyme catalase chính có mặt ở trong lá, với nhiệm vụ là bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương oxy hóa bằng cách xúc tác q trình chuyển hóa hydrogen peroxide thành nước và oxy phân tử. Hoạt tính của hai glutathione S-transferase (GSTF) là GSTF9 và GSTF23 có dấu hiệu giảm rõ rệt trong điều kiện cực đoan [45].
Mặc dù việc oxy hóa và khử gốc oxy hóa ở các gốc Met trong calmodulin và các protein truyền tín hiệu canxi khác đã được chứng minh là tham gia vào việc điều hòa chức năng protein [26, 28, 78], tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ [26, 45, 84]. Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu
về biểu hiện của các dạng oxy phản ứngtrong phảnứng bảo vệ của cây đậu (Pisum
sativumL.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại cơn trùng chích hút nhựa cây có mức độ pháhoại được đánh giá là nguy hiểm đối với nhiều cây trồng họ Fabaceae [1]. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một lồi dược liệu quý được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam [3].
Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay, vẫn chưa có bất kỳ cơng bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của Msr trên thực vật.
Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy, chúng tơi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây
Arabidopsis thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt
Arabidopsis thaliana kiểu dại chủng Columbia (Col-0) được sử dụng cho các thí
nghiệm. Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dịng FOX, cDNA hồn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa. Dòng cây chuyển gen biểu hiện quá mức gen At3G55240 đã được nghiên cứu bởi Ichikawa và cs (2006) [43].
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu.
STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích
1 Murashige & Skoog medium
chứa các vitamin Duchefa (Hà Lan) Môi trường nảy mầm hạt và thử mức độ nhạy cảm với điều kiện bất lợi 2 Hygromycin B Sigma (Mỹ)
3 Natri clorua Merck (Mỹ)
4 Paraquat diclorua Syngenta (Indonesia) 5 Cadmium clorua Himedia (Ấn Độ)
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị và máy móc thuộc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong Bả ng 2.2.
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Cân phân tích Sartorius (Đức) 2 Cân kỹ thuật Sartorius (Đức) 3 Máy cất nước Hamilton (Anh) 4 Nồi hấp tiệt trùng tự động Tomy (Nhật Bản) 5 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ)
6 Tủ lạnh –20C và 4C Panasonic (Nhật Bản) 7 Tủ sấy Memmert (Đức)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1.
2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học
2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP
Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nơng nghiệp. Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu
Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java.
Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) [85] và phần mềm Blast2go Basic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen
thành 3 nhóm: tham gia vào các q trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành phần của tế bào.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu
Dự đốn vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào. Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ chức cao nên chức năng của protein trong các q trình sinh học có mối liên hệ chặt chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào. Trong những năm gần đây, nhiều cơng
Danh sách các gen mã hóa MRP
Chú giải chức năng các gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Cây Arabidopsis biểu hiện quá mức hoặc bị đột biến gen ứng viên
Đánh giá hình thái Thử nghiệm điều kiện bất lợi
Thử kháng mặn nặng CadmiumThử kim loại Thử paraquat
TIN SINH
HỌC
THỰC NGHIỆM
cụ dự đoán được phát triển. Phần lớn các cơng cụ này dựa vào thuật tốn nội suy, xác định vị trí cư trú của protein thơng qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự đặc hiệu của các protein đã biết [58]. Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác. Cụ thể, TargetP chỉ tập trung xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory pathway signal peptide). Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein nằm trong lục lạp. pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58]. Trong nghiên cứu này, để dự đốn vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa tồn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để
tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) [27], pSORT (http://www.psort.org/) [41], và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [92]. Trong đó, vị trí cư trú nằm trên lục lạp được dự đoán bằng ChloroP và pSORT. Vị trí cư trú nằm trên ty thể được dự đoán bằng pSORT và CELLO.
2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi
Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65]. Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:
Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phịng ni trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon ). Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới nước đầy đủ trong tuần đầu tiên. Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ được ngừng tưới nước trong vịng 10 ngày. Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích microarray. Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là
GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247 [65].
Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu
dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phịng ni trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon). Cây 10 ngày tuổi trên mơi trường GM đã được chuyển sang mơi trường ½ MS đặc khơng có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200 mM NaCl và được giữ trong vịng 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần). Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen. Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514 [64]. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu.
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP. Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với