Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat trên dịng cây đối chứng và dòng cây RBC1
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1.
2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học
2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP
Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp. Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu
Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java.
Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) [85] và phần mềm Blast2go Basic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen
thành 3 nhóm: tham gia vào các q trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành phần của tế bào.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu
Dự đốn vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào. Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ chức cao nên chức năng của protein trong các q trình sinh học có mối liên hệ chặt chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào. Trong những năm gần đây, nhiều cơng
Danh sách các gen mã hóa MRP
Chú giải chức năng các gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Cây Arabidopsis biểu hiện quá mức hoặc bị đột biến gen ứng viên
Đánh giá hình thái Thử nghiệm điều kiện bất lợi
Thử kháng mặn nặng CadmiumThử kim loại Thử paraquat
TIN SINH
HỌC
THỰC NGHIỆM
cụ dự đoán được phát triển. Phần lớn các cơng cụ này dựa vào thuật tốn nội suy, xác định vị trí cư trú của protein thơng qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự đặc hiệu của các protein đã biết [58]. Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác. Cụ thể, TargetP chỉ tập trung xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory pathway signal peptide). Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein nằm trong lục lạp. pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58]. Trong nghiên cứu này, để dự đốn vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa tồn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để
tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) [27], pSORT (http://www.psort.org/) [41], và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [92]. Trong đó, vị trí cư trú nằm trên lục lạp được dự đốn bằng ChloroP và pSORT. Vị trí cư trú nằm trên ty thể được dự đoán bằng pSORT và CELLO.
2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi
Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65]. Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:
Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phịng ni trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon ). Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới nước đầy đủ trong tuần đầu tiên. Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ được ngừng tưới nước trong vịng 10 ngày. Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích microarray. Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là
GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247 [65].
Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu
dại (chủng Columbia) được gieo trên mơi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phịng ni trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon). Cây 10 ngày tuổi trên môi trường GM đã được chuyển sang mơi trường ½ MS đặc khơng có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200 mM NaCl và được giữ trong vịng 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần). Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen. Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514 [64]. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu.
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP. Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết như Bảng 2.3. Trình tự 1-
kb ngược dịng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4 [82].
Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [90]
Yếu tố cis Trình tự nhận biết
ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYBR (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C MYCR CACATG
ICEr2 ACTCCG RSRE CGCGTT
2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm
2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240
Hạt giống Arabidopsis chuyển gen và hạt đối chứng được xử lý sơ bộ bằng ethanol 70% trong 5 phút, sau đó được khử trùng tiếp bằng dung dịch NaClO nồng độ 1% trong thời gian 1 phút. Tiếp theo rửa hạt 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ các phần dư thừa của hóa chất vơ trùng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây con sau này.
Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên
đĩa petri chứa mơi trường ½ MS đặc có và khơng có kháng sinh hygromycin, trong điều kiện của phịng ni cấy mơ tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phịng ni 24±2oC. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau.
2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên
mơi trường ½ MS có và khơng có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang mơi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên mơi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.
Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen
và cây đối chứng trên mơi trường ½ MS có và khơng có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang mơi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750 µM. Cây sống sót trên mơi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8.
Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành
dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91] có cải biến. Gieo hạt cây chuyển gen và đối chứng trên mơi trường ½ MS đặc có và khơng có kháng sinh Hygromycin. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong
dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu của lá sau 24 giờ.
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP
3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis
Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nơng nghiệp (Phụ lục). Trong số tồn bộ AtMRP, hàm lượng Met lớn 7 % được tìm thấy ở 47 gen (chiếm 38,8 % tổng số gen mã hóa cho MRP), đặc biệt có 2 gen AT4G16980 và AT1G33820
mã hóa cho phân tử protein có kích thước tương ứng là 164 và 182 axit amin, chứa 15,95 % và 16,02 % Met.
MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Theo Thimm và cs (2004), MAPMAN xác định chức năng của gen có thể tham gia vào một phần của quá trình trao đổi chất, hoặc có chức năng cụ thể (như tổng hợp protein), đáp ứng sinh học (như gen tham gia vào trao đổi chất và/ hoặc đáp ứng với hormone), hoặc mã hóa cho các họ enzyme mà chức năng của chúng chưa rõ [85]. Kết quả phân tích cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong tế bào. Số cịn lại đóng vai trị quan trọng trong tế bào (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trong đó, điều hịa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP. Bên cạnh đó, một số MRP cũng phân bố rải rác trong các chu trình quan trọng khác như liên kết và vận chuyển kim loại, tương tác với yếu tố bất lợi, xử lý RNA sau phiên mã, chu kỳ tế bào, liên quan đến sự phát triển của tế bào. Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào thực vật.
Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN
Nhóm chức năng gen AtMRP
Kiểm soát ion kim loại 2 Phản ứng điều kiện bất lợi 1 Xử lý RNA 4 Điều hòa phiên mã RNA 20 Biến đổi protein 12 Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) 6 Chu trình tế bào 3 Sự phát triển 1 Vận chuyển (kim loại) 6 Chưa biết chức năng 56
(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)
Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các q trình sinh học khác nhau của
Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm
BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: q trình sinh học (Hình 3.2), thành phần của tế bào (Hình 3.3) và chức năng phân tử (Hình 3.4). Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào.
Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học
Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào
(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)
Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử
Lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ra ROS ở mức độ cao. Như vậy, việc xác định vị trí hoạt động của MRP trong bào quan có thể góp phần làm sáng tỏ về chức năng của chúng. Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tơi đã sử dụng 3 công cụ bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đốn dựa trên trình tự polypeptide của 121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đốn có đích đến ở lục lạp bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự đoán là cư trú trong ty thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Bảng
3.2 và Hình 3.5). Trong đó, chỉ có 2 protein cùng được dự đốn là nằm trên lục lạp
bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1 protein cũng được dự đốn ở ty thể bởi pSORT và CELLO (Hình 3.5).
Hình 3.5. Dự đốn vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO
Việc có ít trùng lặp trong kết quả dự đoán giữa các phương pháp tin sinh học về vị trí lưu trú của các protein đặc hiệu đã được nhóm tác giả Liu và cs nêu rõ, cụ thể là do sự khác nhau trong thuật toán và cơ sở dữ liệu mẫu của mỗi phương pháp nên thường các cơng cụ dự đốn khác nhau cho ra những kết quả cũng khá là khác nhau [58]. Do đó, chúng tôi quan tâm nhiều hơn đến tổng số lượng dự đốn của MRP có kết quả là đích đến là lục lạp và ty thể từ cả 2 phần mềm, bởi kết quả này có thể bổ trợ cho nhau.
10 2 9 ChloroP pSORT A. Lục lạp 21 2 1 6 CELLO pSORT B. Ty thể 9
Bảng 3.2. Các MRP được dự đốn có đích tác động là ty thể và lục lạp
TT Tên protein Chloro P WoLF PSORT CELLO
Lục lạp Lục lạp Ty thể Ty thể 1 At1G06960.3 Y 2 At1G10590.3 Y 3 At1G22590.1 Y Y 4 At1G32560.1 Y 5 At1G33860.1 Y 6 At1G49800.1 Y 7 At1G68160.1 Y 8 At2G07708.1 Y Y 9 At2G26975.1 Y 10 At2G46600.1 Y 11 At3G07560.1 Y 12 At3G11160.1 Y 13 At3G28190.1 Y 14 At3G28990.1 Y 15 At3G29070.1 Y 16 At3G43410.1 Y 17 At3G46900.1 Y 18 At3G59900.1 Y 19 At4G08395.1 Y 20 At4G32470.2 Y Y 21 At4G34590.1 Y 22 At5G26673.1 Y 23 At5G41170.1 Y 24 At5G59030.1 Y 25 At5G59040.1 Y Y 26 At5G61710.1 Y Y 27 ATMG00500.1 Y 28 ATMG00650.1 Y Tổng số 12 11 3 7
Để tăng mức độ tin cậy của kết quả, chúng tơi đã kiểm chứng lại vị trí bào quan mà 121 AtMRP cư trú bằng phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0. Sử dụng
công cụ Graphs, lựa chọn mục Cellular Component trong GO Category, đã đếm được 9 trình tự AtMRP trên ty thể (Hình 3.6). Điều này làm tăng mức độ tin cậy từ kết quả dự đốn về đích đến của MRP trong tế bào. Như đã biết, lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ROS [31], chính điều này làm các MRP cư trú trong đó dễ dàng bị oxy hóa khi dư lượng ROS tăng cao do yếu tố bất lợi tác động. Như vậy, kết quả dự đốn vị trí cư trú của MRP trong tế bào bước đầu có thể nhận định được vai trị của chúng tham gia trong các bào quan.
Hình 3.6. Dự đốn vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm Blast2GO
Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động q trình oxy hóa và khử Met trong thực vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan trọng trong tế bào như kiểm sốt q trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+. Sản phẩm của các gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp phần làm sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào.
3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi kiện thường và điều kiện bất lợi
Ban đầu, dữ liệu microarray của gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis kiểu dại ở điều kiện bình thường so với điều kiện chịu mặn và hạn hán [54, 64] được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Trong tổng số 121 gen AtMRP, dữ liệu biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26 %) được ghi nhận số liệu (Phụ lục). Tất cả các gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ 2 lần được coi là có biểu hiện đáp ứng với điều kiện bất lợi. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ