Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat trên dịng cây đối chứng và dòng cây RBC1
3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP
3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện
kiện thường và điều kiện bất lợi
Ban đầu, dữ liệu microarray của gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis kiểu dại ở điều kiện bình thường so với điều kiện chịu mặn và hạn hán [54, 64] được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Trong tổng số 121 gen AtMRP, dữ liệu biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26 %) được ghi nhận số liệu (Phụ lục). Tất cả các gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ 2 lần được coi là có biểu hiện đáp ứng với điều kiện bất lợi. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ phiên mã thay đổi trong điều kiện chịu mặn và/hoặc điều kiện hạn. Trong điều kiện chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và giảm ít nhất 2 lần. Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương ứng là cao hơn và thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng tăng gấp hơn 2 lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực đoan trong thí nghiệm (Hình 3.7). Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện
chịu hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được chỉ ra ở Bảng 3.3.
Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán
Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao
TT Tên gen Met
(%)
Chiều dài (axit amin)
Số lần thay đổi ở mức độ biểu hiện Mô tả gen
Xử lý hạn Xử lý mặn
1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA nhóm I
2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết
3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9 Biểu hiện quá mức dẫn đến sự “giả vàng
úa dưới ánh sáng”
4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết
5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến
yếu tố MYC
6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0 Gen giả mã hóa cho protein trong họ chuỗi
truyền điện tử P450
7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết
8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11
9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài
Gen At4G33467, mã hóa cho protein chưa biết đến chức năng và là gen có biểu hiện tăng mạnh nhất trong điều kiện hạn hán, mức độ thay đổi gấp hơn 330 lần so với nhóm đối chứng. Một gen khác như At1G32560, mã hóa cho protein
chứa vùng domain LEA nhóm 1 liên quan đến sự cảm ứng với điều kiện mất nước, gen này tăng mức biểu hiện gấp khoảng 135 lần trong điều kiện hạn. Gen mã hóa cho protein LEA như At1G32560 có vai trị trong quá trình phát triển muộn của
phơi. LEA thường xuất hiện nhiều trong hạt và các mẫu mô thực vật trong điều kiện bất lợi như khô hạn, chịu mặn, nhiệt độ căng thẳng. Họ protein LEA được chứng minh rằng khi tăng cường biểu hiện sẽ giúp thực vật có khả năng chống chịu tốt hơn trong điều kiện chịu mặn [64]. Bên cạnh đó, gen At3G62090 mã hóa cho yếu tố phiên mã bHLH (helix loop helix-HLH) được đặc trưng bởi cấu trúc xoắn-vịng-xoắn cơ bản, có mức độ biểu hiện được tăng cường gấp 64 và 2 lần trong khi xử lý hạn và mặn. Ngược lại, trong số các gen có biểu hiện giảm,
At3G55240 bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất, mức độ biểu hiện của gen này bị
giảm tương ứng khoảng 60 và 26 lần trong điều kiện hạn và mặn. Ichikawa và cs (2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng “giả vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều
dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp). Các trình tự tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ lúa nhưng khơng được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen mã hóa cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật [43]. Tuy nhiên, chưa có bất kỳ một cơng bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tơi đã chọn At3G55240 là
gen ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với cây trồng trong các điều kiện cực đoan.
Trong Arabidopsis, có đến 50% gen mã hóa MRP có biểu hiện thay đổi
trong điều kiện bất lợi đều thuộc nhóm protein chưa biết được chức năng (Bảng
3.4). Số cịn lại được dự đốn là giữ các chức năng khác nhau trong tế bào, quan
phiên mã RNA protein giúp thực vật phản ứng với điều kiện bất lợi. Trong 6
AtMRP mã hóa cho protein tham gia vào q trình tín hiệu Ca2+, 3 gen có biểu hiện đáp ứng trong điều kiện mặn hoặc hạn hán: 1 gen có đáp ứng tăng cường biểu hiện và 2 gen có biểu hiện đáp ứng giảm biểu hiện (Bảng 3.4). Điều đó cho thấy rằng tín hiệu Ca2+ đóng vai trị quan trọng trong q trình phát tín hiệu khi thực vật chịu điều kiện bất lợi phi sinh học. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó về vai trị của calmodulin trong quá trình cân bằng ROS ở thực vật [4, 78, 81]. Hoạt tính xúc tác của catalase điều hịa nồng độ H2O2 trong Arabidopsis, bị kích thích bởi phức hệ Ca2+/calmodulin để duy trì mức độ cân bằng nội môi H2O2 [4]. Bên cạnh đó, có đến 13/20 AtMRP đóng vai trị là các nhân tố điều hòa phiên mã RNA, gồm 7 gen mã hóa MRP được tăng cường biểu hiện và 6 gen mã hóa MRP bị giảm biểu hiện với điều kiện hạn hán và/hoặc điều kiện chịu mặn.
At3G62090, At5G42325 và At4G34590 đều là những nhân tố phiên mã được tăng
cường biểu hiện trong cả điều kiện hạn hán và chịu mặn. At3G62090 thuộc họ
protein có cấu trúc cơ bản xoắn vòng xoắn (bHLH) hay còn gọi là nhân tố tương tác với phytochrome (PIF). Penfield và cs đã chỉ ra rằng PIF đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt các tín hiệu từ môi trường tác động đến thực vật, đặc biệt là phản ứng với ánh sáng trong quá trình này mầm của hạt. Gen At3G62090 mã hóa cho PIF6. Trong điều kiện ánh sáng đỏ mạnh, PIF6 làm cho trụ dưới lá mầm ngắn hơn, trong khi dưới điều kiện ánh sáng xanh thì trụ dưới lá mầm lại có hình thái bình thường hay khác biệt không đáng kể [67]. At4G34590 hay cịn gọi là gen mã hóa cho nhân tố điều hịa phiên mã bZIP11 (basic region-leucine zipper). bZIP11 biểu hiện trong toàn bộ đời sống của thực vật và đặc biệt là ở các mô mạch như các gân xung quanh lá. Đặc biệt là biểu hiện ngoại bào mạnh của bZIP11 gây nên sự ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [59].
Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi
Nhóm chức năng gen AtMRP1
srMRP2
Biểu hiện tăng Biểu hiện giảm Tổng số
Kiểm soát ion kim loại 2 1 - 1
Phản ứng điều kiện bất lợi 1 1 - 1
Xử lý RNA 4 - - -
Điều hòa phiên mã RNA 20 7 6 13
Biến đổi protein 12 1 1 2
Tín hiệu (Ca2+) 6 1 2 3
Chu trình tế bào 3 - 1 1
Sự phát triển 1 1 - 1
Vận chuyển (kim loại) 6 1 3 4
Chưa biết chức năng 56 13 13 26
1 Số lượng các gen, một gen có thể tham gia nhiều hơn một nhóm chức năng 2 srAtMRP: MRP có biểu hiện đáp ứng với điều kiện cực đoan
3.1.3. Dự đốn yếu tố điều hịa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi
Yếu tố cis nằm trong vùng promoter của gen đóng vai trị như vị trí nhận biết và bám của các nhân tố phiên mã, cần thiết cho việc biểu hiện của gen đặc hiệu cho các mô hay các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi. Khi phân tích promoter của các gen, một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra, và cũng là yếu tố điều khiển quan trọng liên quan đến hoạt động của các gen tham gia kiểm sốt q trình phản ứng với điều kiện bất lợi [2]. Do đó, để xác định các gen ứng viên
AtMRP có thể liên quan đến quá trình phản ứng với điều kiện cực đoan trên
A.thaliana, 5 yếu tố cis liên quan đến phản ứng với điều kiện bất lợi đã được tìm
kiếm trong vùng 1-kb ngược dịng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của các gen mã hóa MRP. Kết quả về dự đốn một số yếu tố cis trên promoter của các gen mã hóa MRP được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP
TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE
1 At1G10586.2 1 2 At1G20790.1 1 1 3 At1G32560.1 3 4 At1G40104.1 1 5 At1G43320.1 1 6 At1G56085.1 1 7 At1G63057.1 1 1 8 At1G64405.1 1 9 At1G67350.1 1 10 At1G68160.1 1 11 At1G68240.1 1 12 At1G72510.1 3 1 13 At1G76640.1 14 At1G77682.1 1 15 At2G07708.1 1 16 At2G17200.1 1 1 17 At2G27030.2 1 18 At2G41780.1 2 19 At3G10640.2 2 1 20 At3G11530.1 3 21 At3G11825.1 1 1 22 At3G16960.1 1 1 23 At3G23050.1 1 1 24 At3G28990.1 1 25 At3G29070.1 1 26 At3G44935.1 1 27 At3G49270.3 1 28 At3G50360.1 1 29 At3G52270.1 1 30 At3G55240.1 1 31 At3G56610.1 1 1 32 At3G59900.1 1 33 At3G62090.1 1 34 At3G62420.1 1 35 At4G00850.1 1 36 At4G02450.1 1 37 At4G12334.1 1 38 At4G12860.1 1 39 At4G16980.1 1 40 At4G20440.1 1 41 At4G32470.2 2 1
TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE 42 At5G21990.1 1 43 At5G26673.1 1 44 At5G37860.1 1 45 At5G39570.1 1 46 At5G41170.1 1 47 At5G42325.1 1 48 At5G49500.1 1 49 At5G59030.1 1 1 50 At5G59040.1 1 51 At5G67060.1 1 1 52 ATMG00500.1 1 53 ATMG00650.1 1 1 Tổng 23 26 16 5 4
Cả 5 yếu tố cis đều được tìm thấy trong các gen AtMRP. Trong đó, MYBR
được tìm thấy trong 21 gen AtMRP, ABRE có mặt trong 19 gen AtMRP, 16 gen AtMRP có chứa MYC, 5 gen AtMRP có chứa ICEr2 và RSRE có mặt trong 4 gen AtMRP (Hình 3.8). Khi phân tích sự có mặt của một số yếu tố cis nằm vùng promoter
của AtMRP, ABRE được tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA nhóm I. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra rằng 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng promoter [42].
Trong nghiên cứu này, chúng tơi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP. Ở Arabidopsis, 6
gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán và độ mặn cao có trung bình 0,83 yếu tố cis này trên promoter của mỗi gen. Điều này cho thấy sự tăng về tần số xuất hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP có mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn.
Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau
3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen
At3G55240 (dòng RBC1)
3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen
Dựa trên các kết quả phân tích tin sinh học, gen ứng viên At3G55240 có mức độ biểu hiện giảm rất mạnh trong cả điều kiện hạn hán và độ mặn cao đã được chọn để tiến hành thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Câu hỏi được đặt ra là At3G55240 có vai trị sinh học gì trong cơ thể sinh vật? Một phương pháp tiếp cận để nghiên cứu chức năng gen là tăng cường biểu hiện gen dựa vào dịng chuyển gen biểu hiện cDNA hồn chỉnh của Arabidopsis. Kiểu hình của cá thể mang gen chuyển có thể khơng
thay đổi nếu vẫn giữ được ít nhất một bản sao bình thường của gen cần chuyển (dị hợp tử). Do đó, dịng chuyển gen bắt buộc phải chứa cả hai allen mang gen cần chuyển (đồng hợp tử) để có thể tiến hành được các nghiên cứu về biểu hiện chức năng gen trong cơ thể.
Chính vì vậy, hạt giống dịng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen
At3G55240 (gọi tắt là dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác
0 5 10 15 20 25
ABRE MYB MYC ICEr2 RSRE
S
ố
ge
n
định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử. Hạt chuyển gen được khử trùng và gieo đồng thời trên mơi trường ½ MS đặc có và khơng có kháng sinh hygromycin. Kết quả nảy mầm hạt cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng sinh hygromycin được thể hiện qua Hình 3.9. Như vậy kết quả này cho thấy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là đồng hợp tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức nảy mầm và sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ mẩy và lép của hạt thí nghiệm.
Hình 3.9. Dịng cây RBC1 được nảy mầm, A. mơi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B. mơi trường ½ MS đặc
3.2.2. Đánh giá hình thái của dịng cây chuyển gen
a. Hình thái cây trên đĩa thạch
Hạt dịng cây chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng được gieo trên môi trường ½ MS. Đĩa cây được đặt trong phịng ni cấy mơ ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14 ngày tuổi. Kết quả so sánh hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.10. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch
ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dịng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dịng cây đối chứng.
Hình 3.10. Hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch
b. Hình thái cây trên giá thể đất
Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½MS chuyển sang giá thể đất, đặt trong phịng ni cấy mô ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả so sánh hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.11. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng. Sự khác biệt này bắt đầu được nhận thấy từ cây 7 ngày tuổi và càng thể hiện rõ nét khi cây phát triển dần. Ichikawa và cs cũng đã ghi nhận kiểu hình khác biệt này ở dịng cây RBC1 [43]. Kiểu hình này tương tự như cây vàng úa trong điều kiện ánh sáng yếu hay còn gọi là “sự giả vàng úa dưới ánh sáng” gọi tắt là PEL (Pseudo-Etiolation in Light).
Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại khơng ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của dịng RBC1 [43]. Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường ngoại trừ khả năng tổng
hợp tinh bột thấp hơn so với dòng đối chứng [43]. Các dòng tăng cường biểu hiện gen At3G55240 trong ngân hàng các dòng FOX của RIKEN đều có mức độ phiên mã của gen được tăng lên 1x103 cho đến hơn 1x108 lần so với cây kiểu dại [43]. Khi mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng thì số lượng lục lạp càng giảm. Như
vậy, mức độ biểu hiện của At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp của cây [43].
Bên cạnh đó, gen At3G55240 được dự đốn là có ảnh hưởng đến q trình phát triển sớm của cây. Ichikawa và cs đã nghiên cứu để làm giảm biểu hiện gen này bằng