3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen
At3G55240 (dòng RBC1)
3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen
Dựa trên các kết quả phân tích tin sinh học, gen ứng viên At3G55240 có mức độ biểu hiện giảm rất mạnh trong cả điều kiện hạn hán và độ mặn cao đã được chọn để tiến hành thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Câu hỏi được đặt ra là At3G55240 có vai trị sinh học gì trong cơ thể sinh vật? Một phương pháp tiếp cận để nghiên cứu chức năng gen là tăng cường biểu hiện gen dựa vào dịng chuyển gen biểu hiện cDNA hồn chỉnh của Arabidopsis. Kiểu hình của cá thể mang gen chuyển có thể khơng
thay đổi nếu vẫn giữ được ít nhất một bản sao bình thường của gen cần chuyển (dị hợp tử). Do đó, dịng chuyển gen bắt buộc phải chứa cả hai allen mang gen cần chuyển (đồng hợp tử) để có thể tiến hành được các nghiên cứu về biểu hiện chức năng gen trong cơ thể.
Chính vì vậy, hạt giống dịng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen
At3G55240 (gọi tắt là dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác
0 5 10 15 20 25
ABRE MYB MYC ICEr2 RSRE
S
ố
ge
n
định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử. Hạt chuyển gen được khử trùng và gieo đồng thời trên mơi trường ½ MS đặc có và khơng có kháng sinh hygromycin. Kết quả nảy mầm hạt cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng sinh hygromycin được thể hiện qua Hình 3.9. Như vậy kết quả này cho thấy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là đồng hợp tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức nảy mầm và sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ mẩy và lép của hạt thí nghiệm.
Hình 3.9. Dịng cây RBC1 được nảy mầm, A. mơi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B. mơi trường ½ MS đặc
3.2.2. Đánh giá hình thái của dịng cây chuyển gen
a. Hình thái cây trên đĩa thạch
Hạt dịng cây chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng được gieo trên mơi trường ½ MS. Đĩa cây được đặt trong phịng ni cấy mơ ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14 ngày tuổi. Kết quả so sánh hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.10. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch
ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dịng cây đối chứng.
Hình 3.10. Hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch
b. Hình thái cây trên giá thể đất
Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½MS chuyển sang giá thể đất, đặt trong phịng ni cấy mô ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả so sánh hình thái dịng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.11. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng. Sự khác biệt này bắt đầu được nhận thấy từ cây 7 ngày tuổi và càng thể hiện rõ nét khi cây phát triển dần. Ichikawa và cs cũng đã ghi nhận kiểu hình khác biệt này ở dịng cây RBC1 [43]. Kiểu hình này tương tự như cây vàng úa trong điều kiện ánh sáng yếu hay còn gọi là “sự giả vàng úa dưới ánh sáng” gọi tắt là PEL (Pseudo-Etiolation in Light).
Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại khơng ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của dịng RBC1 [43]. Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường ngoại trừ khả năng tổng
hợp tinh bột thấp hơn so với dòng đối chứng [43]. Các dòng tăng cường biểu hiện gen At3G55240 trong ngân hàng các dòng FOX của RIKEN đều có mức độ phiên mã của gen được tăng lên 1x103 cho đến hơn 1x108 lần so với cây kiểu dại [43]. Khi mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng thì số lượng lục lạp càng giảm. Như
vậy, mức độ biểu hiện của At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp của cây [43].
Bên cạnh đó, gen At3G55240 được dự đốn là có ảnh hưởng đến q trình phát triển sớm của cây. Ichikawa và cs đã nghiên cứu để làm giảm biểu hiện gen này bằng RNA can thiệp nhưng chỉ thu được các dòng cây bị chết rất sớm trong giai đoạn đầu của sự phát triển. Các dịng cây phát triển được như bình thường thì lại khơng hề ghi nhận được sự giảm biểu hiện của gen này ở mức độ phiên mã [43]. Do đó, bất hoạt gen
At3G55240 chỉ thu được kiểu hình gây chết ở giai đoạn phát triển sớm. Chính vì vậy,
biểu hiện q mức gen At3G55240 là phương pháp tiếp cận duy nhất để bước đầu xác định vai trò của gen đối với Arabidopsis trong một số điều kiện bất lợi.
3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi
Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phịng vệ, gen At3G55240 được biểu hiện q mức trong cây mơ hình A. thaliana và thử nghiệm phản ứng của cây trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Gieo dòng hạt chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng kiểu dại trên mơi trường ½ MS tương ứng có và khơng có kháng sinh hygromycin 15mg/l . Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 12 ngày tuổi chuyển sang 3 loại mơi trường: (i) Mơi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Mơi trường ½ MS, có bổ sung CdCl2 ở nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại 3 lần. (iii) Mơi trường ½ MS: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên mơi trường NaCl và CdCl2 bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Kết quả thử nghiệm chống chịu với điều kiện mặn ở nồng độ NaCl 175 mM được biểu hiện trên Hình 3.12 và Hình 3.13.
Kết quả này cho thấy cả dòng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8, số lượng cây chết trắng hồn tồn ở dịng cây chuyển gen tăng lên nhanh hơn so với dòng cây đối chứng (sau 8 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 6/15 cây sống sót trong khi dịng cây đối chứng còn 9/15 cây). Điều này được ghi nhận ở cả 3 lần lặp lại thí nghiệm. Như vậy, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao.
Triệu chứng dễ nhận thấy nhất đối với Arabidopsis chịu điều kiện bất lợi gây ra bởi kim loại nặng Cd là lá vàng úa và cuộn lại do mất cân bằng nước và rối loạn q trình đóng mở khí khổng. Lá cây vàng úa là do Cd làm thay đổi tỷ lệ Fe : Zn và gây nên những ảnh hưởng tiêu cực trong quá trình trao đổi chất ở lục lạp [24]. Sau 5 ngày kể từ ngày chuyển sang mơi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, lá của dịng cây RBC-1 bắt đầu có hiện tượng vàng úa dần dần. Như vậy, RBC-1 xuất hiện triệu chứng bị gây độc bởi Cd sớm hơn so với giống cây kiểu dại. Sau đó, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 8 của thí nghiệm, dịng cây RBC-1 đều cho thấy cây chết vàng với tốc độ nhanh hơn (sau 7 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 6/15 cây sống sót trong khi dịng cây đối chứng cịn 10/15 cây sống sót) (Hình 3.12 và Hình 3.14). Kết quả này được ghi nhận ở 3 lần lặp lại thí nghiệm. Do vậy, dễ dàng nhận thấy rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana cũng làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở nồng độ cao.
Cuối cùng, dòng cây RBC1 được so sánh với dòng cây đối chứng trong thí nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat. Lá cây Arabidopsis 3 tuần tuổi từ dòng chuyển gen RBC1 và dòng cây đối chứng kiểu dại được cắt rời và ngâm vào dung dịch paraquat ở nồng độ 0 µM (nồng độ đối chứng chỉ chứa dung dịch H2O khử trùng) và các nồng độ thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Đĩa thí nghiệm được ghi nhận kết quả sau 24 giờ chiếu sáng liên tục. Paraquat là hợp chất có hoạt tính khử, ngun nhân sinh ra anion superoxide trong tế bào được ghi nhận ở Arabidopsis và Nicotiana benthamian. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào [91].
Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dịng cây đối chứng và dòng cây RBC1
Kết quả của thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã của gen
At3G55240 trong dịng RBC1 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat
(Hình 3.15). Lá của dòng RBC1 xử lý với paraquat bị mất diệp lục và trở nên trắng hoàn toàn chỉ sau 24 giờ xử lý. Điều này được nhận thấy ở tất cả các nồng độ sử dụng trong thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Ngược lại, dịng cây đối chứng bị mất diệp lục ở mức độ chậm hơn so với RBC1. Bên cạnh đó, giữa các nồng độ thì biểu hiện của
dịng cây đối chứng cũng có sự khác nhau rõ rệt: ở nồng độ 1 µM và 2 µM, tốc độ mất màu diệp lục là tương tự nhau và nhanh hơn so với nồng độ paraquat 0,5 µM. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này, nồng độ paraquat 0,5 µM được xem như là nồng độ tối ưu nhất để so sánh vì sự khác biệt là rõ ràng nhất giữa dòng RBC1 và dịng đối chứng.
Tóm lại, việc biểu hiện q mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana cho thấy sự gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào trong điều kiện chịu mặn, bị gây độc bởi CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat, được thể hiện qua mức độ gây chết tế bào ở mức nhanh hơn so với kiểu dại. Điều này gợi ý rằng gen At3G55240 có thể đóng vai trị trong q trình loại bỏ ROS. Ở thực vật, ROS đóng vai trị tín hiệu quan trọng như chất truyền tin thứ hai trong việc kích hoạt cơ chế phịng thủ chống lại điều kiện bất lợi [13]. Khi nhận được tín hiệu từ ROS dưới điều kiện căng thẳng oxy hóa, thực vật thường phản ứng lại bằng cách kích hoạt một loạt cơ chế phản ứng phức tạp để khử ROS, nhờ hoạt động của các chất loại bỏ ROS có và khơng có bản chất enzyme. Do đó, biểu hiện mạnh mẽ của protein có vai trị dọn dẹp ROS ở giai đoạn đầu của điều kiện bất lợi sẽ làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phịng thủ, giảm khả năng kháng lại của thực vật [89].
Hiện nay, chưa có một cơng bố chính thức nào về việc tăng cường mức độ biểu hiện của protein khử ROS lại làm tăng tính nhạy cảm của cây đối với điều kiện bất lợi phi sinh học và ngược lại. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề này khi cây gặp phải điều kiện bất lợi sinh học [61, 62, 89]. Tương tự như khi gặp phải điều kiện bất lợi về mặt phi sinh học, thực vật cũng có những phản ứng phịng vệ để chống lại sự tấn công của mầm bệnh và các yếu tố sinh học khác, nguyên nhân sản sinh ra ROS như H2O2 và superoxide. Trên đối tượng cây thuốc lá (Nicotiana
tabacum), biểu hiện của ascorbate peroxidase bị ức chế ở mức độ sau phiên mã trong
suốt quá trình đưa tế bào vào chết theo chu trình khi cây bị mầm bệnh tấn cơng [61]. Cây thuốc lá chuyển gen làm giảm biểu hiện của ascorbate peroxidase hay catalase bị giảm biểu hiện lại cho thấy chống chịu tốt hơn khi bị mầm bệnh tấn cơng [62]. Metallothionein là protein giàu cysteine, có khối lượng phân tử nhỏ (6-7 kDa). Bên
cạnh đó, metallothionein được xác định là có vai trị trong việc dọn dẹp ROS và cân bằng kim loại bên trong tế bào [89]. Cây lúa (Oryza sativa) biểu hiện quá mức gen
OsMT2b mã hóa cho metallothionein lại làm tăng mức độ mẫn cảm của cây đối với
vi khuẩn gây bệnh bạc lá và nấm gây bệnh đạo ôn [89].
Bên cạnh đó, ảnh hưởng của MRP đến phản ứng của cây trước một số điều kiện bất lợi cũng được nghiên cứu. Calmodulin là protein được tập trung nghiên cứu về ảnh hưởng của oxy hóa Met đến việc rối loạn và làm mất chức năng của protein [18, 30, 78]. Đây là protein đóng vai trị quan trọng liên quan đến khả năng chống chịu với những điều kiện cực đoan ở cây trồng. Đột biến cây Arabidopsis bằng cách chèn thêm đoạn T-DNA vào 7 gen mã hóa cho calmodulin đã góp phần khẳng định vai trị đặc biệt của các gen này đến quá trình chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi gây ra bởi paraquat và H2O2; cụ thể, các đột biến gen mã hóa calmodulin 5 và calmodulin 6 cho thấy sự tăng tính nhạy cảm đối với paraquat và H2O2 trong quá trình nảy mầm và sinh trưởng của hạt [4].
Protein sốc nhiệt Hsp21 cũng là protein đích được nghiên cứu nhiều q trình oxy hóa Met và ảnh hưởng của nó đối với cây trồng [35-37, 80]. Gen mã hóa cho Hsp21 được tăng cường biểu hiện trong cây A. thaliana dưới sự kiểm soát của
promoter CaMV 35S và dịng cây chuyển gen khơng hề cho thấy sự sai khác gì đáng kể về mặt kiểu hình. Tuy nhiên, khi thực hiện thí nghiệm chịu nhiệt dưới điều kiện ánh sáng có cường độ mạnh 4 giờ mỗi ngày, đồng nghĩa với việc tạo điều kiện bất lợi về mặt oxy hóa, thì dịng cây chuyển gen và cây đối chứng cho thấy sự khác biệt rõ rệt. Dịng cây biểu hiện mạnh Hsp21 ít bị ảnh hưởng và trọng lượng tươi vẫn lớn hơn dòng cây đối chứng [80]. Do vậy, protein này giúp tăng cường sự sống sót cho tế bào thực vật trong những điều kiện bất lợi oxy hóa [80].
Chính vì vậy, thơng qua nghiên cứu này, gen At3G55240 được dự đốn là mã hóa cho protein đóng vai trị trong việc triệt tiêu ROS. Tuy nhiên, trong giai đoạn đầu kích hoạt q trình phịng thủ, việc biểu hiện quá mức của một protein đóng vai trò dọn dẹp ROS lại là một bất lợi đối với cây trồng khi tín hiệu kích thích phản vệ khơng còn mạnh mẽ. Kết quả này bước đầu sẽ cung cấp những dẫn liệu cho nghiên
cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trị của gen mã hóa MRP liên quan đến tính chống chịu ở thực vật, về đích tác động của Msr bên cạnh một số MRP được công bố trước đây như calmodulin và hsp21.
KẾT LUẬN
Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Hệ gen của cây Arabidopsis thaliana có chứa 121 gen mã hóa MRP,
trong đó khoảng 50% đã biết chức năng là đóng các vai trị quan trọng trong quá trình của tế bào như tham gia vào tín hiệu Ca2+, kiểm sốt q trình phiên mã RNA. Trong số này có 21 MRP có đích đến ở lục lạp và 9 MRP cư trú ở ty thể.
2. Trong tổng số gen mã hóa MRP ở Arabidopsis có 39 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện hạn hán, 28 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện mặn. Trong đó, gen At3G55240 có biểu hiện giảm rất mạnh ở cả 2 điều kiện là hạn hán và mặn.
3. Dòng cây Arabidopsis chuyển gen RBC1 biểu hiện quá mức gen At3G55240 sinh trưởng và phát triển tốt, tuy nhiên lại có đặc điểm hình thái
đặc trưng của sự giả vàng úa dưới ánh sáng. Dòng cây chuyển gen RBC1 mẫn cảm hơn (nhạy cảm hơn) với điều kiện mặn, CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat.