Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat trên dịng cây đối chứng và dòng cây RBC1
3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen At3G5
3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi
Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phịng vệ, gen At3G55240 được biểu hiện q mức trong cây mơ hình A. thaliana và thử nghiệm phản ứng của cây trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Gieo dòng hạt chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng kiểu dại trên mơi trường ½ MS tương ứng có và khơng có kháng sinh hygromycin 15mg/l . Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 12 ngày tuổi chuyển sang 3 loại mơi trường: (i) Mơi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Mơi trường ½ MS, có bổ sung CdCl2 ở nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại 3 lần. (iii) Mơi trường ½ MS: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên mơi trường NaCl và CdCl2 bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Kết quả thử nghiệm chống chịu với điều kiện mặn ở nồng độ NaCl 175 mM được biểu hiện trên Hình 3.12 và Hình 3.13.
Kết quả này cho thấy cả dịng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8, số lượng cây chết trắng hồn tồn ở dịng cây chuyển gen tăng lên nhanh hơn so với dòng cây đối chứng (sau 8 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 6/15 cây sống sót trong khi dịng cây đối chứng cịn 9/15 cây). Điều này được ghi nhận ở cả 3 lần lặp lại thí nghiệm. Như vậy, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao.
Triệu chứng dễ nhận thấy nhất đối với Arabidopsis chịu điều kiện bất lợi gây ra bởi kim loại nặng Cd là lá vàng úa và cuộn lại do mất cân bằng nước và rối loạn q trình đóng mở khí khổng. Lá cây vàng úa là do Cd làm thay đổi tỷ lệ Fe : Zn và gây nên những ảnh hưởng tiêu cực trong quá trình trao đổi chất ở lục lạp [24]. Sau 5 ngày kể từ ngày chuyển sang mơi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, lá của dịng cây RBC-1 bắt đầu có hiện tượng vàng úa dần dần. Như vậy, RBC-1 xuất hiện triệu chứng bị gây độc bởi Cd sớm hơn so với giống cây kiểu dại. Sau đó, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 8 của thí nghiệm, dịng cây RBC-1 đều cho thấy cây chết vàng với tốc độ nhanh hơn (sau 7 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 6/15 cây sống sót trong khi dịng cây đối chứng cịn 10/15 cây sống sót) (Hình 3.12 và Hình 3.14). Kết quả này được ghi nhận ở 3 lần lặp lại thí nghiệm. Do vậy, dễ dàng nhận thấy rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana cũng làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở nồng độ cao.
Cuối cùng, dòng cây RBC1 được so sánh với dòng cây đối chứng trong thí nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat. Lá cây Arabidopsis 3 tuần tuổi từ dòng chuyển gen RBC1 và dòng cây đối chứng kiểu dại được cắt rời và ngâm vào dung dịch paraquat ở nồng độ 0 µM (nồng độ đối chứng chỉ chứa dung dịch H2O khử trùng) và các nồng độ thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Đĩa thí nghiệm được ghi nhận kết quả sau 24 giờ chiếu sáng liên tục. Paraquat là hợp chất có hoạt tính khử, ngun nhân sinh ra anion superoxide trong tế bào được ghi nhận ở Arabidopsis và Nicotiana benthamian. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào [91].
Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dịng cây RBC1
Kết quả của thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã của gen
At3G55240 trong dịng RBC1 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat
(Hình 3.15). Lá của dòng RBC1 xử lý với paraquat bị mất diệp lục và trở nên trắng hoàn toàn chỉ sau 24 giờ xử lý. Điều này được nhận thấy ở tất cả các nồng độ sử dụng trong thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Ngược lại, dịng cây đối chứng bị mất diệp lục ở mức độ chậm hơn so với RBC1. Bên cạnh đó, giữa các nồng độ thì biểu hiện của
dịng cây đối chứng cũng có sự khác nhau rõ rệt: ở nồng độ 1 µM và 2 µM, tốc độ mất màu diệp lục là tương tự nhau và nhanh hơn so với nồng độ paraquat 0,5 µM. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này, nồng độ paraquat 0,5 µM được xem như là nồng độ tối ưu nhất để so sánh vì sự khác biệt là rõ ràng nhất giữa dòng RBC1 và dịng đối chứng.
Tóm lại, việc biểu hiện q mức At3G55240 trên cây mơ hình A. thaliana cho thấy sự gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào trong điều kiện chịu mặn, bị gây độc bởi CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat, được thể hiện qua mức độ gây chết tế bào ở mức nhanh hơn so với kiểu dại. Điều này gợi ý rằng gen At3G55240 có thể đóng vai trị trong q trình loại bỏ ROS. Ở thực vật, ROS đóng vai trị tín hiệu quan trọng như chất truyền tin thứ hai trong việc kích hoạt cơ chế phịng thủ chống lại điều kiện bất lợi [13]. Khi nhận được tín hiệu từ ROS dưới điều kiện căng thẳng oxy hóa, thực vật thường phản ứng lại bằng cách kích hoạt một loạt cơ chế phản ứng phức tạp để khử ROS, nhờ hoạt động của các chất loại bỏ ROS có và khơng có bản chất enzyme. Do đó, biểu hiện mạnh mẽ của protein có vai trị dọn dẹp ROS ở giai đoạn đầu của điều kiện bất lợi sẽ làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phịng thủ, giảm khả năng kháng lại của thực vật [89].
Hiện nay, chưa có một cơng bố chính thức nào về việc tăng cường mức độ biểu hiện của protein khử ROS lại làm tăng tính nhạy cảm của cây đối với điều kiện bất lợi phi sinh học và ngược lại. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề này khi cây gặp phải điều kiện bất lợi sinh học [61, 62, 89]. Tương tự như khi gặp phải điều kiện bất lợi về mặt phi sinh học, thực vật cũng có những phản ứng phịng vệ để chống lại sự tấn công của mầm bệnh và các yếu tố sinh học khác, nguyên nhân sản sinh ra ROS như H2O2 và superoxide. Trên đối tượng cây thuốc lá (Nicotiana
tabacum), biểu hiện của ascorbate peroxidase bị ức chế ở mức độ sau phiên mã trong
suốt quá trình đưa tế bào vào chết theo chu trình khi cây bị mầm bệnh tấn công [61]. Cây thuốc lá chuyển gen làm giảm biểu hiện của ascorbate peroxidase hay catalase bị giảm biểu hiện lại cho thấy chống chịu tốt hơn khi bị mầm bệnh tấn cơng [62]. Metallothionein là protein giàu cysteine, có khối lượng phân tử nhỏ (6-7 kDa). Bên
cạnh đó, metallothionein được xác định là có vai trị trong việc dọn dẹp ROS và cân bằng kim loại bên trong tế bào [89]. Cây lúa (Oryza sativa) biểu hiện quá mức gen
OsMT2b mã hóa cho metallothionein lại làm tăng mức độ mẫn cảm của cây đối với
vi khuẩn gây bệnh bạc lá và nấm gây bệnh đạo ôn [89].
Bên cạnh đó, ảnh hưởng của MRP đến phản ứng của cây trước một số điều kiện bất lợi cũng được nghiên cứu. Calmodulin là protein được tập trung nghiên cứu về ảnh hưởng của oxy hóa Met đến việc rối loạn và làm mất chức năng của protein [18, 30, 78]. Đây là protein đóng vai trị quan trọng liên quan đến khả năng chống chịu với những điều kiện cực đoan ở cây trồng. Đột biến cây Arabidopsis bằng cách chèn thêm đoạn T-DNA vào 7 gen mã hóa cho calmodulin đã góp phần khẳng định vai trị đặc biệt của các gen này đến quá trình chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi gây ra bởi paraquat và H2O2; cụ thể, các đột biến gen mã hóa calmodulin 5 và calmodulin 6 cho thấy sự tăng tính nhạy cảm đối với paraquat và H2O2 trong quá trình nảy mầm và sinh trưởng của hạt [4].
Protein sốc nhiệt Hsp21 cũng là protein đích được nghiên cứu nhiều q trình oxy hóa Met và ảnh hưởng của nó đối với cây trồng [35-37, 80]. Gen mã hóa cho Hsp21 được tăng cường biểu hiện trong cây A. thaliana dưới sự kiểm soát của
promoter CaMV 35S và dịng cây chuyển gen khơng hề cho thấy sự sai khác gì đáng kể về mặt kiểu hình. Tuy nhiên, khi thực hiện thí nghiệm chịu nhiệt dưới điều kiện ánh sáng có cường độ mạnh 4 giờ mỗi ngày, đồng nghĩa với việc tạo điều kiện bất lợi về mặt oxy hóa, thì dịng cây chuyển gen và cây đối chứng cho thấy sự khác biệt rõ rệt. Dịng cây biểu hiện mạnh Hsp21 ít bị ảnh hưởng và trọng lượng tươi vẫn lớn hơn dòng cây đối chứng [80]. Do vậy, protein này giúp tăng cường sự sống sót cho tế bào thực vật trong những điều kiện bất lợi oxy hóa [80].
Chính vì vậy, thơng qua nghiên cứu này, gen At3G55240 được dự đốn là mã hóa cho protein đóng vai trị trong việc triệt tiêu ROS. Tuy nhiên, trong giai đoạn đầu kích hoạt q trình phịng thủ, việc biểu hiện quá mức của một protein đóng vai trò dọn dẹp ROS lại là một bất lợi đối với cây trồng khi tín hiệu kích thích phản vệ khơng còn mạnh mẽ. Kết quả này bước đầu sẽ cung cấp những dẫn liệu cho nghiên
cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trị của gen mã hóa MRP liên quan đến tính chống chịu ở thực vật, về đích tác động của Msr bên cạnh một số MRP được công bố trước đây như calmodulin và hsp21.
KẾT LUẬN
Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Hệ gen của cây Arabidopsis thaliana có chứa 121 gen mã hóa MRP,
trong đó khoảng 50% đã biết chức năng là đóng các vai trị quan trọng trong quá trình của tế bào như tham gia vào tín hiệu Ca2+, kiểm sốt q trình phiên mã RNA. Trong số này có 21 MRP có đích đến ở lục lạp và 9 MRP cư trú ở ty thể.
2. Trong tổng số gen mã hóa MRP ở Arabidopsis có 39 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện hạn hán, 28 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện mặn. Trong đó, gen At3G55240 có biểu hiện giảm rất mạnh ở cả 2 điều kiện là hạn hán và mặn.
3. Dòng cây Arabidopsis chuyển gen RBC1 biểu hiện quá mức gen At3G55240 sinh trưởng và phát triển tốt, tuy nhiên lại có đặc điểm hình thái
đặc trưng của sự giả vàng úa dưới ánh sáng. Dòng cây chuyển gen RBC1 mẫn cảm hơn (nhạy cảm hơn) với điều kiện mặn, CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat.
KIẾN NGHỊ
Để tiếp tục phát triển kết quả nghiên cứu trong phạm vi của đề tài, chúng tơi có một số kiến nghị như sau:
1. Sử dụng các phương pháp thực nghiệm, ví dụ phương pháp phân tích hình thái và phương pháp thử nghiệm trên một số điều kiện bất lợi, để làm rõ hơn vai trị của một số gen mã hóa MRP chưa biết chức năng mà có đáp ứng phiên mã mạnh với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra trong nghiên cứu này, ví dụ gen At4G34590 được tăng cường biểu hiện lên đến 337,5 lần trong điều
kiện hạn hán.
2. Mở rộng nghiên cứu, trước mắt trong phạm vi lĩnh vực tin sinh học, đối với MRP trên các cây nông nghiệp quan trọng khác như lúa gạo, ngô và sắn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Mai Văn Chung (2014), “Các gốc oxy tự do trong phản ứng bảo vệ của cây đậu đối với rệp hại”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nghệ An, 3: 16-19.
2. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(1): 1- 18.
3. Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014), “Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) trồng tại Phú Yên”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(3): 412-421.
Tài liệu tiếng Anh
4. Al-Quraan, N.A., Locy, R.D., Singh, N.K. (2011), "Implications of paraquat and hydrogen peroxide-induced oxidative stress treatments on the GABA shunt pathway in Arabidopsis thaliana calmodulin mutants", Plant Biotechnology Reports, 5(3): 225-234.
5. Altenbach, S.B., Pearson, K.W., Leung, F.W., Sun, S.S. (1987), "Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a Brazil nut protein exceptionally rich in methionine", Plant Molecular Biology, 8(3): 239-250.
6. Altenbach, S.B.,Simpson, R.B. (1990), "Manipulation of methionine-rich protein genes in plant seeds", Trends in Biotechnology, 8: 156-160.
7. Amir, R. (2008), "Towards improving methionine content in plants for enhanced nutritional quality", Function Plant Science Biotechnology, 2: 36-46. 8. Amir, R., Hacham, Y., Galili, G. (2002), "Cystathionine γ-synthase and threonine synthase operate in concert to regulate carbon flow towards methionine in plants", Trends in Plant Science, 7(4): 153-156.
9. Apel, K.,Hirt, H. (2004), "Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction", Annual Review Plant Biology, 55: 373-399. 10. Bartlem, D., Lambein, I., Okamoto, T., Itaya, A., Uda, Y., Kijima, F., Tamaki,
Y., Nambara, E., Naito, S. (2000), "Mutation in the threonine synthase gene results in an over-accumulation of soluble methionine in Arabidopsis", Plant Physiology, 123(1): 101-110.
11. Benavides, M.P., Gallego, S.M., Tomaro, M.L. (2005), "Cadmium toxicity in plants", Brazilian Journal of Plant Physiology, 17(1): 21-34.
12. Benn, G., Wang, C.Q., Hicks, D.R., Stein, J., Guthrie, C., Dehesh, K. (2014), "A key general stress response motif is regulated non-uniformly by CAMTA transcription factors", Plant Journal, 80(1): 82-92.
13. Bhattacharjee, S. (2005), "Reactive oxygen species and oxidative burst: roles in stress, senescence and signal", Current Science, 89: 1113-1121.
14. Bourgis, F., Roje, S., Nuccio, M.L., Fisher, D.B., Tarczynski, M.C., Li, C., Herschbach, C., Rennenberg, H., Pimenta, M.J., Shen, T.-L. (1999), "S- methylmethionine plays a major role in phloem sulfur transport and is synthesized by a novel type of methyltransferase", The Plant Cell, 11(8): 1485- 1497.
15. Brosnan, J.T.,Brosnan, M.E. (2006), "The sulfur-containing amino acids: an overview", The Journal of Nutrition, 136(6): 1636-1640.
16. Brot, N., Weissbach, L., Werth, J., Weissbach, H. (1981), "Enzymatic reduction of protein-bound methionine sulfoxide", Proceedings of the National Academy
of Sciences, 78(4): 2155-2158.
17. Burke, E.J., Brown, S.J., Christidis, N. (2006), "Modeling the recent evolution of global drought and projections for the twenty-first century with the Hadley Centre climate model", Journal of Hydrometeorology, 7(5): 1113-1125.
18. Carruthers, N.J.,Stemmer, P.M. (2008), "Methionine Oxidation in the Calmodulin-Binding Domain of Calcineurin Disrupts Calmodulin Binding and Calcineurin Activation", Biochemistry, 47(10): 3085-3095.
19. Chai, J. (2013), "Roles of SRF in Endothelial Cells During Hypoxia", in
Research Directions in Tumor Angiogenesis, InTech, 2: 29-46.
20. Chakraborty, S., Chakraborty, N., Datta, A. (2000), "Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from
Amaranthus hypochondriacus", Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(7): 3724-3729.
21. Clemens, S. (2006), "Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants", Biochimie, 88(11): 1707-1719.
22. Coleman, C.E., Larkins, B.A. (1999), "The prolamins of maize", in seed Proteins, Springer, 6: 109-139.
23. Couturier, J., Chibani, K., Jacquot, J.P., Rouhier, N. (2013), "Cysteine–based redox regulation and signaling in plants", Frontiers in Plant Science, 4: 105. 24. DalCorso, G., Farinati, S., Maistri, S., Furini, A. (2008), "How plants cope with
cadmium: staking all on metabolism and gene expression", Journal of Integrative Plant Biology, 50(10): 1268-1280.
25. Deinlein, U., Stephan, A.B., Horie, T., Luo, W., Xu, G., Schroeder, J.I. (2014), "Plant salt-tolerance mechanisms", Trends in Plant Science, 19(6): 371-379. 26. Drazic, A.,Winter, J. (2014), "The physiological role of reversible methionine
oxidation", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics,
1844(8): 1367-1382.
27. Emanuelsson, O., Nielsen, H., Brunak, S., von Heijne, G. (2000), "Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence", Journal of Molecular Biology, 300(4): 1005-1016.
28. Erickson, J.R., Mei-ling, A.J., Guan, X., Kutschke, W., Yang, J., Oddis, C.V., Bartlett, R.K., Lowe, J.S., O'Donnell, S.E., Aykin-Burns, N. (2008), "A dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKII by methionine oxidation", Cell, 133(3): 462-474.
29. Galili, G.,Höfgen, R. (2002), "Metabolic engineering of amino acids and storage proteins in plants", Metabolic Engineering, 4(1): 3-11.
30. Gao, J., Yao, Y., Squier, T.C. (2001), "Oxidatively Modified Calmodulin Binds