2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH
2.2.1.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi tổng hợp đầu dò
Cặp mồi tổng hợp đầu dò bắt cặp với gen IL–6 được thiết kế dựa trên trình tự
cADN của gen bằng chương trình thiết kế mồi trực tuyến Primer3.
Đánh giá độ đặc hiệu (theo lý thuyết) của cặp mồi: các cặp mồi đã thiết kế được kiểm tra khả năng tổng hợp sản phẩm với vector chuyển gen và hệ gen gà Gallus
gallus domesticus bằng công cụ tìm kiếm BLAST (Basic Local Alignment
2.2.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò
Trong nghiên cứu này, để xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ Mg2+ của phản ứng.
Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 6.
Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6
Thành phần Nồng độ phản ứng
dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0,25 mM
MgCl2 1 – 4 mM
IL6F primer 0,5 mM
IL6R primer 0,5 mM
Taq DNA polymerase 0,1 U/µl
PCR buffer 1 X
Khuôn tổng hợp 0,5 ng/µl
Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên
35 chu kỳ
biến tính 94oC trong 30 giây
gắn mồi ở gradient nhiệt độ 45–55oC trong 30 giây tổng hợp 72oC trong 30 giây 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng
Đánh giá hàm lượng ADN được tổng hợp: (1) điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, nhuộm với Ethidium bromide 10 µg/ml trong 10 phút và quan sát trên máy soi gel, (2) tinh sạch sản phẩm PCR và đo hàm lượng sản phẩm bằng máy định lượng ADN Biophotometer Plus (Eppendorf).
Đánh giá độ chính xác trình tự của sản phẩm: Sản phẩm PCR được giải trình tự trên hệ thống Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer, phân tích bằng phần mềm BioEdit nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm PCR với trình tự đầu dị theo thiết kế.
2.2.1.3. Phương pháp tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR: Tương tự các thành phần trong Bảng 6, trong đó nồng độ Mg2+ được sử dụng theo nồng độ tối ưu đã xác định, nồng độ dTTP giảm xuống 0,17 mM, bổ sung Alexa Fluor® 568–5–dUTP sao cho nồng độ cuối cùng là 0,08 mM.
Chu kỳ nhiệt:
94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên
35 chu kỳ
biến tính 94oC trong 30 giây
gắn mồi theo nhiệt độ tối ưu trong 60 giây tổng hợp 72oC trong 60 giây và thêm 2 giây sau mỗi chu kỳ 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng
Kiểm tra sản phẩm: Lấy 3 µl sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1,5%, sau đó quan sát trực tiếp dưới máy soi mà không nhuộm Ethidium bromide.
Sản phẩm sau tổng hợp được tinh sạch bằng Kit Wizard® SV Gel & PCR Clean–
Up System (Promega) để sử dụng cho phản ứng lai FISH.