Trong những điều kiện nuôi cấy cụ thể, bổ sung các yếu tố tăng trưởng (Bảng 7) cũng như có sự góp mặt của lớp tế bào ni, cESCs có khả năng duy trì in
vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc điểm đa tiềm năng [45, 64]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột (đã bị bất hoạt phân bào bằng Mitomycin C 10 μg/ml) để nuôi cấy cESCs. Những nghiên cứu trước đây trên thế giới cũng như tại phịng thí nghiệm của chúng tơi đã chứng minh loại tế bào này có khả năng hỗ trợ ESCs tốt nhất [1, 24, 69]. Khi đó cESCs có xu hướng xâm lấn xuống dưới lớp tế bào nuôi và bám trực tiếp vào bề mặt đĩa ni cấy (Hình 19), điểm này khá tương đồng với kết quả nghiên cứu trước đây của Pettite và cộng sự [69]. Hiện tại chúng tơi đã duy trì được cESCs qua 28 ngày nuôi cấy với ba lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm của tế bào gốc phơi. Việc duy trì cESCs
in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được trạng thái đa tiềm năng có ý nghĩa lớn
trong việc hình thành cơ thể khảm khi tiêm chúng vào phôi nhận, tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc.
Hình 19. cESCs ni cấy trên lớp tế bào nuôi
(A) Nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào trước khi được sử dụng làm tế bào nuôi; (B) Quần lạc cESCs ở lần cấy chuyển thứ hai (F2) sinh trưởng trên lớp tế bào nuôi.
3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phơi gà chuyển gen
Trong nghiên cứu này, vector có nguồn gốc lentivirus là pLenti6/V5–DEST (Gateway) đã chèn gen IL–6 người được lựa chọn sử dụng. Khi tế bào sinh trưởng có độ che phủ trên 90% diện tích bề mặt đĩa ni cấy thì được thu nhận để thực hiện chuyển gen. Những tế bào này được phân tách bằng trypsin và thu nhận bằng ly tâm, sau đó được ủ cùng các hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào). Tế bào sau
chuyển gen được cấy vào đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm (có sẵn lớp tế bào) với mật độ 0,5x106 tế bào/đĩa, nuôi bằng môi trường nuôi cấy tương ứng trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%.
Ngoài ra, một đĩa tế bào không qua xử lý lentivirus được nuôi cấy song song làm đối chứng nhằm đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới cESCs. Cả hai đĩa tế bào đều được quan sát hằng ngày và so sánh dưới kính hiển vi soi ngược. Kết quả đánh giá cho thấy: tế bào được xử lý cùng virus cũng như đối chứng vẫn phát triển bình thường, khơng xuất hiện các tế bào chết nổi trên bề mặt, cESCs vẫn giữ được những đặc điểm hình thái của tế bào gốc đa tiềm năng (Hình 20). Kết quả này bước đầu chứng minh được vector lentivirus hầu như không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cESCs. Tuy nhiên để có kết luận chính xác cần những nghiên cứu sâu hơn nữa. Hiện nay chúng tôi đã thu nhận và bảo quản lạnh sâu được năm quần thể cESCs sau chuyển nhiễm để tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs
cESCs được thâm nhiễm vector lentivirus và đối chứng được ni cấy hồn tồn tương tự
biệt nhau đáng kể ở cả thế hệ F0 và F2, sinh trưởng bình thường, duy trì các đặc điểm đặc
trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR
Trong nghiên cứu này, cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế (sản phẩm khuếch đại 289 bp) được sử dụng để kiểm tra sự có mặt gen IL–6 trong các mẫu tế bào sau chuyển nhiễm. Đồng thời, cặp mồi khuếch đại đoạn ADN kích thước 321 bp trong gen ribosome 18S cũng được sử dụng làm chứng nội. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu tế bào chuyển gen thể hiện ở Hình 21. Các mẫu tế bào chuyển gen xuất hiện cả hai băng có kích thước 289 bp (IL–6) và 321 bp (18S), trong khi mẫu đối chứng chỉ quan sát được một băng duy nhất của gen 18S.
Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen
(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)
Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không được chuyển nhiễm; (E1101, E1102, E1203) Các mẫu tế bào được chuyển gen.
Để kiểm tra gen chuyển có được duy trì ổn định qua các thế hệ tế bào hay không, chúng tơi thực hiện phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen qua mỗi lần cấy chuyển. Kết quả kiểm tra cho thấy, sau hơn 20 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển, gen chuyển vẫn được duy trì ổn định trong hệ gen của cESCs. Tất cả các mẫu tế bào chuyển gen và trải qua các lần cấy chuyển đều cho kết quả dương tính với phản ứng PCR.
Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển
(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)
Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không được chuyển nhiễm; (E1203: F1, F2, F3) Mẫu tế bào E1203 trải qua lần lượt 3 lần
cấy chuyển.
Vector pLenti6/V5-DEST không thể nhân lên trong tế bào chất của cESCs. Bên cạnh tâm tái bản trong E. coli, vector chứa tâm tái bản của Simian vacuolating virus 40 (SV40 origin), hoạt động trên các loại tế bào người và khỉ biểu hiện mạnh kháng nguyên T lớn SV40 (như COS–7, 293T) và một số dòng tế bào chuột (như CHO) [70]. Đến nay chưa có báo cáo nào về hoạt động của SV40 origin trên tế bào những loài khác. Ngoài ra, cESCs được phân tích PCR đã trải qua q trình ni cấy dài ngày, ADN được tách bằng kit cung cấp bởi hãng Roche đặc hiệu với ADN hệ gen. Vì vậy, bước đầu có thể khẳng định băng 289 bp được phát hiện trong các phản ứng PCR do gen IL–6 đã chèn vào ADN trong nhân tế bào.
3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs
Tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 được gắn lên lam, xử lý qua RNase và pepsin, sau đó ủ cùng 10 µl Hybridization Buffer (chứa 5 ng/µl đầu dị), biến tính ở 70oC trong 10 phút và lai ở 65oC qua đêm. Sau khi lai, tiêu bản được hạ từ từ nhiệt độ xuống 37oC, rửa qua Wash Buffer (chứa formamide 20% để biến tính các đoạn lai khơng đặc hiệu) và SSC 2x, tiếp tục ủ cùng Detection Buffer (BSA 5%; Tween 20 nồng độ 0,2%; pha trong SSC 4X) trong 30 phút. Các mẫu được nhuộm DAPI 2
µg/ml trong 10 phút trước khi phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang Axioplan 2 (Carl Zeiss).
Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người
(ĐC) Mẫu đối chứng; (TN) mẫu chuyển gen E110–F2. Nhân tế bào được nhuộm với DAPI
bắt màu xanh lam. Các vị trí bắt cặp đặc hiệu giữa đầu dị đánh dấu Alexa Fluor® 568 và ADN đích có màu đỏ (vị trí mũi tên).
Tín hiệu huỳnh quang thu được thể hiện ở Hình 23. Nhân tế bào bắt màu với thuốc nhuộm DAPI có màu xanh lam. Ở mẫu thí nghiệm có những tế bào chứa vị trí ADN trong nhân tế bào bắt cặp với đầu dị cho tín hiệu huỳnh quang màu đỏ. Kết quả này cho thấy mẫu thí nghiệm đã được phát hiện gen chuyển IL–6 bằng đầu dò
đặc hiệu gắn Alexa Fluor® 568, đồng thời gen đã được đưa vào nhân tế bào. Có thể dễ dàng nhận thấy các vị trí này phát tín hiệu với cường độ khơng đồng đều, ngun nhân có thể giải thích do số lượng Alexa Fluor® 568–5–dUTP được gắn vào các đầu dị khơng giống nhau.
3.4. THẢO LUẬN
Trong thời gian gần đây, gà chuyển gen là đối tượng nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong ứng dụng sản xuất các protein tái tổ hợp. Nhiều sinh phẩm có nguồn gốc từ người đã được nghiên cứu tạo ra trên gà với mục đích ứng dụng điều trị bệnh, như hormone FSH, kháng thể đơn dòng miR24, interferon β–1a, interferon α–2a ,… [28, 52]. Ở Việt Nam, ứng dụng công nghệ chuyển gen trên động vật là hướng nghiên cứu còn mới mẻ, những kết quả đạt được còn rất hạn chế do yêu cầu đầu tư về kỹ thuật và cơ sở vật chất. Các thành tựu về gà chuyển gen mới chỉ được công bố bởi nhóm nghiên cứu của cố GS. TS. Nguyễn Mộng Hùng và TS. Nguyễn Lai Thành (ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội). Đề tài khoa học trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” đã thu được những thành công bước đầu trong việc ứng dụng một số phương pháp chuyển gen trên gà để tạo ra protein tái tổ hợp ở lòng trắng trứng [2, 10]. So với phương pháp thông qua tinh trùng và vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn X, tạo gà chuyển gen dựa trên tế bào gốc phơi có ưu điểm là lựa chọn được biến đổi di truyền không gây hại từ trước khi tạo thành cơ thể khảm, do đó tiết kiệm thời gian cũng như chi phí cho quá trình tạo dịng [25].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và nhân nuôi cESCs từ đĩa phôi giai đoạn X. Những tế bào này thể hiện những đặc điểm hình thái đặc trưng khi ni cấy in vitro: tế bào tròn với nhân lớn, liên kết không chặt chẽ với nhau tạo thành quần lạc tương tự như ESCs ở nhiều lồi động vật có vú khác. Nguyên bào sợi thai chuột cũng được sử dụng để làm lớp tế bào nuôi, đây là loại tế bào có khả năng hỗ trợ ESCs tăng sinh khơng biệt hóa trong thời gian dài. Hiện nay cESCs đã được duy
trì qua 28 ngày ni cấy với 3 lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.
Khi nghiên cứu biến đổi di truyền cESCs cần chú ý đến các hệ thống vector đủ mạnh để chuyển gen mong muốn với hiệu suất cao và duy trì ổn định trong cơ thể vật chủ. Trước đây, chúng tôi đã thử nghiệm sử dụng các kỹ thuật vật lý (xung điện) và hóa chất (Lipofectamine™ 2000) để chuyển gen EGFP vào cESCs, trong đó gen chuyển đã được phát hiện trong tế bào bằng phản ứng PCR, cũng như biểu hiện thành sản phẩm phát huỳnh quang màu xanh lá cây (kết quả chưa công bố). Tuy nhiên, hiệu suất thu được khá thấp, đồng thời xung điện ảnh hưởng lớn tới sức sống và sự sinh trưởng của tế bào. Ngồi ra, q trình sàng lọc trong thời gian dài ảnh hưởng tới khả năng hội nhập của những tế bào này khi tiêm vào phôi nhận (người ta chưa ghi nhận trường hợp nào cESCs ni cấy q một tuần có khả năng tạo cơ thể khảm dòng sinh dục [51]). Trong nghiên cứu này, vector được sử dụng là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc lentivirus) đã chèn gen IL–6 người. Đây là vector có khả năng chuyển gen cao và ổn định đối với cESCs, tất cả các mẫu cESCs được chuyển nhiễm đều dương tính với phản ứng PCR, đồng thời gen chuyển vẫn được phát hiện trong những mẫu đã trải qua gần 30 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển. Ngồi ra, chúng tơi đã tiêm những tế bào này vào phơi nhận, kết quả phân tích PCR cho thấy gen ngoại lai vẫn được duy trì trong cơ thể gà con [6]. Bên cạnh đó, thực nghiệm cho thấy vector này khá an tồn khi sử dụng, ít ảnh hưởng tới tế bào, đồng thời là những vector tái bản thiếu nên khơng tạo thành virus có hại. Vì vậy, đây thực sự là công cụ chuyển gen đầy tiềm năng.
Để tạo gà chuyển gen, quá trình sàng lọc tế bào biến đổi di truyền như mong muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế bào để có thể truyền lại cho thế hệ sau, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ cơ thể. Hơn nữa, gen ngoại lai phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, nhưng không được chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hịa,... Thực tế, chúng tơi đã vi tiêm những tế bào trên vào phôi nhận, tuy nhiên kết quả thu được rất hạn chế: phôi thường chết ở giai đoạn sớm của
quá trình phát triển, chỉ có khoảng 10% trong số đó nở thành gà con, nguyên nhân có thể do những lý do trên, khiến sức sống của phôi bị ảnh hưởng [6] (xem thêm Phụ lục 3).
Để xác định vị trí gen chuyển trong cESCs, chúng tôi lựa chọn sử dụng kỹ thuật FISH. Nó có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, đặc hiệu và tốc độ tiến hành khá nhanh, nên trở thành trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu cơ bản cũng như chẩn đoán và điều trị [12, 37]. Sử dụng kỹ thuật FISH ở kỳ trung gian của q trình ngun phân, chúng tơi đã phát hiện được gen IL–6 trong nhân tế bào thông
qua tín hiệu huỳnh quang quan sát được dưới kính hiển vi. Phát triển từ nghiên cứu này, chúng tôi đang thử nghiệm thực hiện phản ứng lai ở kỳ giữa nguyên phân nhằm xác định vị trí chính xác của gen chuyển trên nhiễm sắc thể cESCs. Thành công của hướng đi này sẽ tạo tiền đề cho việc dự đoán ảnh hưởng của vị trí chèn gen chuyển tới các gen chức năng khác trong tế bào, từ đó có thể sàng lọc được những tế bào mong muốn để tiêm vào phôi nhận tạo gà khảm.
Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng FISH, hiệu quả chúng tôi thu được không cao. Trong tổng số 10 mẫu cESCs dương tính với phản ứng PCR được phân tích, chỉ có hai mẫu cho kết quả mong muốn (tín hiệu huỳnh quang rõ nét, khơng có nhiễu nền kể cả ở mẫu đối chứng). Một số nguyên nhân đã được đưa ra để giải thích cho vấn đề này. Đầu dị có kích thước tương đối lớn (gần 300 bp), gắn thêm các phân tử phát huỳnh quang Alexa Fluor® 568 cấu trúc khá cồng kềnh (Hình 4) làm giảm khả năng bắt cặp với ADN đích. Thao tác rửa lam sau quá trình phản ứng nhằm loại bỏ sự không đặc hiệu được thực hiện khá nghiêm ngặt, trong đó có sử dụng chất gây biến tính mạnh (formamide) có thể làm mất một phần những phức hệ lai mong muốn. Trong thời gian tới, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa điều kiện thực hiện phản ứng FISH, cũng như cải thiện đầu dò (đánh giá số lượng phân tử huỳnh quang được gắn vào để giảm kích thước đầu dị, tổng hợp đầu dò mạch đơn,…) nhằm nâng cao hiệu quả phân tích.
Mặc dù vậy, đề tài đã đạt được những thành cơng đáng khích lệ. Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam khi sử dụng kỹ thuật FISH, đầu dò huỳnh quang được tổng hợp ngay tại phịng thí nghiệm bằng phương pháp PCR. Sử dụng phương pháp này, nghiên cứu viên có thể chủ động tổng hợp được bất cứ loại đầu dị cho trình tự ADN đã biết nào đó, khơng bị bó hẹp trong phạm vi một gen hay một trình tự nhất định. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần triển khai áp dụng và tiếp tục phát triển nhiều kỹ thuật về sinh học phân tử, sinh học tế bào, di truyền học,... trong nghiên cứu sinh học ở nước ta.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã đưa ra các kết luận như sau:
1. Đã sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để tạo các quần thể tế bào gốc phôi gà mang gen IL–6 người.
2. Đã thiết kế mồi và tổng hợp được đầu dị gắn chất huỳnh quang Alexa Fluor® 568 đặc hiệu với gen IL–6 của người bằng phản ứng PCR.
3. Đã bước đầu thành công trong việc phát hiện gen chuyển IL–6 người trong nhân tế bào gốc phôi gà sau chuyển gen bằng kỹ thuật FISH sử dụng đầu dò tổng hợp được.
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà.
2. Điều chỉnh kích thước đầu dị để nâng cao hiệu quả phản ứng lai FISH.
3. Mở rộng ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện gen trong tế bào, lai với nhiễm sắc thể ở giai đoạn kỳ giữa nguyên phân để xác định vị trí gen trên nhiễm sắc thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Văn Đức, Nguyễn Lai Thành, Bùi Việt Anh, Đỗ Dỗn Lợi (2010), “Nhận biết và ni cấy đơn dịng tế bào gốc phân lập từ nút phơi của túi phôi