3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà
Động lực chính thúc đẩy việc phân lập và ni cấy cESCs là hy vọng rằng chúng có thể được sử dụng để tạo ra gia cầm chuyển gen nhằm tận dụng ưu thế của việc tạo lượng lớn protein albumin trong lòng trắng trứng. Năm 1970, Marzullo là người đầu tiên chuyển cESCs tới đĩa phôi khác và chỉ ra rằng sau 14 ngày ấp, một số tế bào đã hợp nhất vào phôi nhận. Hai thập kỷ sau, Petitte và cộng sự đã chứng minh rằng kỹ thuật đó có thể được sử dụng nhằm tạo ra các cơ thể khảm dòng sinh dục [68].
Chúng tôi tiến hành phân lập cESCs từ đĩa phôi giai đoạn X (0 giờ ấp) theo phương pháp của Horiuchi và cộng sự [32] (ở giai đoạn này phôi chứa khoảng 40.000–60.000 tế bào, đây là những tế bào gốc đa tiềm năng). Tế bào sau khi phân lập được huyền phù hóa bằng mơi trường nuôi cấy và chuyển vào các đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm đã phủ gelatin (khoảng 0,3 x 106 tế bào/đĩa), duy trì trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%. Sau 24 giờ nuôi cấy, cESCs đã bám dính tốt vào đáy đĩa ni cấy và kết hợp với nhau thành quần lạc ESC với những đặc điểm hình thái đặc trưng: tế bào trịn, nhân lớn, chiếm hầu hết tế bào chất, các tế bào liên kết không chặt chẽ với nhau. cESCs lúc này là tập hợp của ba loại tế bào có kích thước khác
nhau: lớn, trung bình và nhỏ (Hình 18). Những đặc điểm này tương đồng với các công bố trước đây về cESCs nhân ni in vitro [64, 69, 88].
Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập
Trong những điều kiện nuôi cấy cụ thể, bổ sung các yếu tố tăng trưởng (Bảng 7) cũng như có sự góp mặt của lớp tế bào ni, cESCs có khả năng duy trì in
vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc điểm đa tiềm năng [45, 64]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột (đã bị bất hoạt phân bào bằng Mitomycin C 10 μg/ml) để nuôi cấy cESCs. Những nghiên cứu trước đây trên thế giới cũng như tại phịng thí nghiệm của chúng tơi đã chứng minh loại tế bào này có khả năng hỗ trợ ESCs tốt nhất [1, 24, 69]. Khi đó cESCs có xu hướng xâm lấn xuống dưới lớp tế bào nuôi và bám trực tiếp vào bề mặt đĩa ni cấy (Hình 19), điểm này khá tương đồng với kết quả nghiên cứu trước đây của Pettite và cộng sự [69]. Hiện tại chúng tơi đã duy trì được cESCs qua 28 ngày nuôi cấy với ba lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm của tế bào gốc phơi. Việc duy trì cESCs
in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được trạng thái đa tiềm năng có ý nghĩa lớn
trong việc hình thành cơ thể khảm khi tiêm chúng vào phôi nhận, tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc.
Hình 19. cESCs ni cấy trên lớp tế bào nuôi
(A) Nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào trước khi được sử dụng làm tế bào nuôi; (B) Quần lạc cESCs ở lần cấy chuyển thứ hai (F2) sinh trưởng trên lớp tế bào nuôi.
3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phơi gà chuyển gen
Trong nghiên cứu này, vector có nguồn gốc lentivirus là pLenti6/V5–DEST (Gateway) đã chèn gen IL–6 người được lựa chọn sử dụng. Khi tế bào sinh trưởng có độ che phủ trên 90% diện tích bề mặt đĩa ni cấy thì được thu nhận để thực hiện chuyển gen. Những tế bào này được phân tách bằng trypsin và thu nhận bằng ly tâm, sau đó được ủ cùng các hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào). Tế bào sau
chuyển gen được cấy vào đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm (có sẵn lớp tế bào) với mật độ 0,5x106 tế bào/đĩa, nuôi bằng môi trường nuôi cấy tương ứng trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%.
Ngoài ra, một đĩa tế bào không qua xử lý lentivirus được nuôi cấy song song làm đối chứng nhằm đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới cESCs. Cả hai đĩa tế bào đều được quan sát hằng ngày và so sánh dưới kính hiển vi soi ngược. Kết quả đánh giá cho thấy: tế bào được xử lý cùng virus cũng như đối chứng vẫn phát triển bình thường, khơng xuất hiện các tế bào chết nổi trên bề mặt, cESCs vẫn giữ được những đặc điểm hình thái của tế bào gốc đa tiềm năng (Hình 20). Kết quả này bước đầu chứng minh được vector lentivirus hầu như không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cESCs. Tuy nhiên để có kết luận chính xác cần những nghiên cứu sâu hơn nữa. Hiện nay chúng tôi đã thu nhận và bảo quản lạnh sâu được năm quần thể cESCs sau chuyển nhiễm để tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs
cESCs được thâm nhiễm vector lentivirus và đối chứng được ni cấy hồn tồn tương tự
biệt nhau đáng kể ở cả thế hệ F0 và F2, sinh trưởng bình thường, duy trì các đặc điểm đặc
trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR
Trong nghiên cứu này, cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế (sản phẩm khuếch đại 289 bp) được sử dụng để kiểm tra sự có mặt gen IL–6 trong các mẫu tế bào sau chuyển nhiễm. Đồng thời, cặp mồi khuếch đại đoạn ADN kích thước 321 bp trong gen ribosome 18S cũng được sử dụng làm chứng nội. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu tế bào chuyển gen thể hiện ở Hình 21. Các mẫu tế bào chuyển gen xuất hiện cả hai băng có kích thước 289 bp (IL–6) và 321 bp (18S), trong khi mẫu đối chứng chỉ quan sát được một băng duy nhất của gen 18S.
Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen
(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)
Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không được chuyển nhiễm; (E1101, E1102, E1203) Các mẫu tế bào được chuyển gen.
Để kiểm tra gen chuyển có được duy trì ổn định qua các thế hệ tế bào hay không, chúng tơi thực hiện phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen qua mỗi lần cấy chuyển. Kết quả kiểm tra cho thấy, sau hơn 20 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển, gen chuyển vẫn được duy trì ổn định trong hệ gen của cESCs. Tất cả các mẫu tế bào chuyển gen và trải qua các lần cấy chuyển đều cho kết quả dương tính với phản ứng PCR.
Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển
(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)
Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không được chuyển nhiễm; (E1203: F1, F2, F3) Mẫu tế bào E1203 trải qua lần lượt 3 lần
cấy chuyển.
Vector pLenti6/V5-DEST không thể nhân lên trong tế bào chất của cESCs. Bên cạnh tâm tái bản trong E. coli, vector chứa tâm tái bản của Simian vacuolating virus 40 (SV40 origin), hoạt động trên các loại tế bào người và khỉ biểu hiện mạnh kháng nguyên T lớn SV40 (như COS–7, 293T) và một số dòng tế bào chuột (như CHO) [70]. Đến nay chưa có báo cáo nào về hoạt động của SV40 origin trên tế bào những loài khác. Ngoài ra, cESCs được phân tích PCR đã trải qua q trình ni cấy dài ngày, ADN được tách bằng kit cung cấp bởi hãng Roche đặc hiệu với ADN hệ gen. Vì vậy, bước đầu có thể khẳng định băng 289 bp được phát hiện trong các phản ứng PCR do gen IL–6 đã chèn vào ADN trong nhân tế bào.