3.1.1.1. Kết quả thiết kế cặp mồi bằng chương trình Primer3
Nhằm tổng hợp và đánh dấu đầu dò cho phản ứng FISH, ba phương pháp thường được sử dụng là dịch chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và PCR. Phương pháp PCR được lựa chọn trong nghiên cứu này với những ưu điểm như độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn, hiệu suất tổng hợp lớn, đồng thời dễ dàng kiểm sốt kích thước đầu dò [59]. Trong phản ứng PCR, mồi (primer) đóng vai trị quyết định, là nơi enzyme Taq polymerase bám và tổng hợp
sợi ADN mới dựa trên trình tự mạch khuôn. Độ đặc hiệu của cặp mồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước, nhiệt độ tách mồi, thành phần nucleotide,... Kích thước mồi thường từ 18–30 nucleotide, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào độ dài đoạn gen đích. Tỷ lệ GC tối ưu của mồi thường được lựa chọn trong khoảng 50- 60% để đảm bảo sự liên kết bền vững với ADN khuôn. Nhiệt độ biến tính (melting temperature – Tm) thể hiện độ bền cấu trúc sợi đơi giữa mồi và ADN đích, có giá trị tối ưu trong khoảng 52–58oC, tỷ lệ thuận với thành phần GC. Mồi được lựa chọn cũng cần đảm bảo không tạo thành cấu trúc bậc hai (tự cuộn gấp), không tự bắt cặp cũng như không bắt cặp với mồi khác (dimer hóa), khơng lặp lại các base cùng loại nhiều hơn ba lần liên tiếp. Khoảng cách giữa hai mồi trên chuỗi đích (độ dài đoạn được khuếch đại) tương đối ngắn, thường không vượt quá 2kb [11, 17].
Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu với cADN của gen IL–6 người sử dụng chương trình Primer3 – một trong những chương trình thiết kế mồi tương đối dễ sử dụng và tốt nhất hiện nay [11]. Độ dài đoạn khuếch đại được giới hạn trong khoảng 300 bp để đánh dấu huỳnh quang với cường độ đủ phát hiện dưới kính hiển vi quang học. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR như đã nêu trên đều được xem xét đến. Kết quả đã thu được năm cặp mồi có thể được sử dụng để tổng hợp đầu dị được trình bày trong Bảng 9. Cặp mồi thứ nhất (có chất
lượng tốt nhất theo đánh giá của chương trình Primer3) được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.
Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3
STT Trình tự Tm (oC) % GC Vị trí bắt cặp Kích thước sản phẩm 1 F: TGC TCC TGG TGT TG 46,2 57,1 53–67 289 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341
2
F: CTG CTC CTG GTG TTG 48,1 60,0 52–67
290 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341
3
F: GCT CCT GGT GTT GC 48,1 64,3 54–68
288 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341
4
F: GCT GCT CCT GGT GT 47,4 64,3 51–65
291 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341
5 F: CTC CTT CTC CAC AAG C 48,9 56,2 6–22 336 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341
3.1.1.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi
Kiểm tra độ đặc hiệu với cADN của gen IL–6
Chúng tôi sử dụng công cụ Nucleotide – BLAST (BLASTn) để đánh giá độ đặc hiệu (về lý thuyết) của cặp mồi được lựa chọn. Cơng cụ này cho phép tìm kiếm các chuỗi ADN gần giống nhất với trình tự mà người dùng chỉ định.
Trình tự được chỉ định có nguồn gốc từ hệ gen người (Homo sapiens), thông tin mARN thể hiện cặp mồi kiểm tra được thiết kế dựa trên trình tự cADN của gen
IL–6. “Score” là số điểm tương đồng giữa hai trình tự so sánh và “Expect” thể hiện
số lượng các trình tự khác tương đồng với mồi được kiểm tra. Hai thông số này thường được quan tâm khi kiểm tra cặp mồi khuếch đại trình tự trong hệ gen: nếu “Score” càng cao và “Expect” càng thấp thì mức độ đặc hiệu càng cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hai giá trị này khơng có ý nghĩa đánh giá vì cặp mồi được
sử dụng cho gen chuyển IL–6 người trong tế bào gà. Cả hai mồi đều cho mức độ tương đồng đạt 100% (Identities = 14/14), trong đó mồi IL6–F cùng chiều (Strand = Plus/Plus) còn mồi IL6–R ngược chiều (Strand = Plus/Minus) với trình tự mARN (Hình 10).
Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6
Thơng tin về vị trí liên kết của mồi với trình tự chỉ định cho thấy vị trí bắt cặp của các mồi IL6–F và IL6–R với mARN lần lượt là 169–182 và 444–457 trên phân tử mARN. Mặt khác, cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN (Hình 11). Từ đây, có thể xác định được vị trí bắt cặp của cặp mồi với cADN tương ứng là 53– 67 (IL6–F) và 327–341 (IL6–R).
Kết quả kiểm tra hồn tồn phù hợp với dự tính khi thiết kế bằng Primer3. Như vậy cặp mồi được thiết kế có độ đặc hiệu và độ nhạy cao với gen chuyển IL–6. Với cặp mồi này, đoạn đầu dò tổng hợp được có trình tự như sau:
1– 51– 101– 151– 201– 251– TGCTCCTGGT GTTGCCTGCT GCCTTCCCTG CCCCAGTACC CCCAGGAGAA GATTCCAAAG ATGTAGCCGC CCCACACAGA CAGCCACTCA CCTCTTCAGA ACGAATTGAC AAACAAATTC GGTACATCCT CGACGGCATC TCAGCCCTGA GAAAGGAGAC ATGTAACAAG AGTAACATGT GTGAAAGCAG CAAAGAGGCA CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAG ATGGCTGAAA AAGATGGATG CTTCCAATCT GGATTCAATG AGGAGACTTG CCTGGTGAA –289
– 50 –100 –150 –200 –250
Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6
cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN. Các mồi IL6–F và IL6–R bắt cặp ở các vị trí 169–182 và 444–457 trên phân tử mARN, tương ứng với các vị trí 53–67 và 327–341 của phân tử cADN.
Kiểm tra khả năng bắt cặp của trình tự đầu dị (theo lý thuyết) với vector chuyển gen
Trong nghiên cứu này, gen IL–6 người được chuyển nhiễm vào tế bào gốc phôi gà thông qua vector pLenti6/V5–DEST (Gateway). Khi vector được đưa vào
trong tế bào và hoạt động, toàn bộ phân đoạn ADN nằm giữa 2 trình tự LTR được chèn vào nhiễm sắc thể tế bào đích. Vì vậy, đầu dị được tổng hợp phải bắt cặp với vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen IL–6 để đảm bảo tính đặc hiệu trong phản ứng lai FISH.
Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector
Vector mang gen chuyển có kích thước 7722 nucleotide. Trình tự cADN được kiểm tra với trình tự vector để xác định vị trí cài nhập của gen vào vector bằng công cụ BLASTn, kết quả cho thấy gen IL–6 được chèn ở vị trí 2485 – 3123 của vector (Hình 12). Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò (tổng hợp từ cặp
mồi đã thiết kế) với vector chuyển gen chứng minh đầu dò bắt cặp vector ở vị trí duy nhất 2537–2835 của vector (Hình 13). Như vậy đoạn đầu dị chỉ tương đồng với trình tự gen chuyển mà khơng có khả năng bắt cặp với bất kỳ trình tự nào khác trên vector.
Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dị trên vector
Đầu dị bắt cặp vector ở vị trí duy nhất 2537–2835 trên vector chuyển gen, nằm trong gen
chuyển IL–6 (2485 – 3123 của vector).
Kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò với hệ gen tế bào gà
Phản ứng lai huỳnh quang sử dụng đầu dò được thực hiện với tế bào gốc phơi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs), vì vậy để đảm bảo tính đặc hiệu thì u cầu với đầu dò là không bắt cặp với hệ gen gà. Kết quả kiểm tra bằng BLASTn cho thấy đầu dò được tổng hợp từ cặp mồi lựa chọn đáp ứng được yêu cầu đó (Hình 14).
Những kết quả về mặt lý thuyết ở trên đã cho thấy cặp mồi được lựa chọn hồn tồn phù hợp cho mục đích phát hiện gen chuyển IL–6 người trong hệ gen gà. Cặp mồi đều có kích thước 14 bp, đặc hiệu với cADN của gen, đoạn ADN được khuếch đại dài 289 bp, bắt cặp với vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen chuyển
và không tương đồng với hệ gen gà. Cặp mồi này được đặt tổng hợp tại hãng Intergrated DNA Technologies (IDT – Hàn Quốc) để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng BLASTn