1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)
1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH
1.2.4.1. Ứng dụng trong phân tích kiểu nhân
Hệ thống nhận dạng nhiễm sắc thể dựa trên kỹ thuật FISH có thể được sử dụng cho mục đích phân tích kiểu nhân. Phản ứng lai có thể tiến hành với một tập hợp các đầu dò khác nhau bằng một hệ thống chất phát huỳnh quang cho những phổ màu khác nhau, vì vậy có thể phát hiện đồng thời tất cả các nhiễm sắc thể trong hệ gen. So với các phương pháp phân tích kiểu nhân truyền thống, chi phí các xét nghiệm FISH chỉ bằng một nửa trong khi thời gian tiến hành thí nghiệm nhanh hơn. Vì vậy, FISH nhanh chóng trở thành một cơng cụ quan trọng và hữu ích cho việc phân tích kiểu nhân, phục vụ cho các nghiên cứu di truyền học tế bào [50, 79].
Năm 1996, hai nhóm nghiên cứu độc lập cơng bố các nghiên cứu phân tích kiểu nhân sử dụng kỹ thuật FISH với 24 màu huỳnh quang, chính là hai kỹ thuật M- FISH và SKY [78, 82]. Ứng dụng các kỹ thuật này, người ta đã xác định được các chuyển đoạn không tương hỗ, tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể trong các tế bào ung thư [76]. Đặc biệt, M-FISH cũng lần đầu tiên chứng minh được ở kỳ trung gian trong quá trình phân bào, các nhiễm sắc thể không phân bố ngẫu nhiên mà mỗi chiếc chiếm một vị trí nhất định trong nhân tế bào (Hình 5) [13, 83].
Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian
(A) Tín hiệu huỳnh quang thu được từ các đầu dò đánh dấu đặc hiệu với 24 nhiễm sắc thể (các cặp 1–22, nhiễm sắc thể giới tính X và Y); (B) Vị trí chính xác của các nhiễm sắc thể
Với các góc độ chụp khác nhau, người ta có thể xây dựng được vị trí khơng gian ba chiều của các nhiễm sắc thể. Kết quả được phân tích trên nguyên bào sợi người [13, 83].
1.2.4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể
FISH là một kỹ thuật mạnh mẽ được sử dụng trong việc phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể như thể dị bội, mất đoạn hay chuyển đoạn [30, 89].
Hiện tượng chuyển đoạn đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật FISH gây bệnh ở người là chuyển đoạn giữa cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 22, tạo nên nhiễm sắc thể Philadelphia. Đột biến này có liên quan mật thiết với bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mãn tính (chronic myelogenous leukemia – CML), 95% những người mắc bệnh gặp bất thường này [71] (một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân được phát hiện hiện tượng chập ba nhiễm sắc thể số 8 [26]). Tuy nhiên chuyển đoạn này khơng phải đặc hiệu để chẩn đốn CML, do nó cũng chiếm một tỷ lệ nhỏ gây nên bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (acute lymphoblastic leukaemia – ALL). Bệnh này cũng lần đầu tiên được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH, trong đó gần 25% các trường hợp bệnh liên quan đến chuyển đoạn giữa cánh ngắn nhiễm sắc thể 12 và cánh dài nhiễm sắc thể 21 [26]. Ngoài ra, còn rất nhiều các bất thường nhiễm sắc thể cũng được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH như một số dạng ung thư, vô sinh, hội chứng Down, Prader – Willi, Angelman, Velocardiofacial,… [75].
Ở Việt Nam, trong vài năm trở lại đây, một số bệnh viện lớn như bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bạch Mai, Nhi Trung ương,… cũng đã đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán ung thư và một số hội chứng giai đoạn trước sinh. Trong giai đoạn 2004–2006, nhóm nghiên cứu thuộc ĐH Y Dược TP. HCM đã nghiên cứu 1302 thai phụ có nguy cơ sinh con dị bội nhiễm sắc thể, phát hiện 136 trường hợp với nhiều dạng khác nhau như chập ba nhiễm sắc thể 13 (hội chứng Patau), chập ba nhiễm sắc thể 18, chập ba nhiễm sắc thể 21 (hội chứng Down), XO, XXX và XXY [3]. Năm 2008, khoa Di truyền và Sinh học phân tử – bệnh viện Nhi Trung ương cũng đã ứng dụng kỹ thuật này để phát hiện một số bất thường trên tế bào lympho B nuôi cấy in vitro như mất đoạn q11–13 ở nhiễm sắc thể 15 gây hội
chứng PraderWilli, mất đoạn q11 ở nhiễm sắc thể X ở bệnh nhân Turner hay mất đoạn trên nhiễm sắc thể 22 [8]. Nhóm nghiên cứu này cũng phối hợp với khoa Sản, bệnh viện Bạch Mai chẩn đoán trước sinh các hội chứng Patau, Down từ tế bào dịch ối của thai 17–25 tuần [9]. Những nghiên cứu này đều sử dụng đầu dò huỳnh quang được thiết kế và tổng hợp bởi các hãng uy tín như Vysis, Kreatech, thu được kết quả khả quan và chính xác, phù hợp với những phân tích nhiễm sắc thể khác.
Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy
(A) Các nhiễm sắc thể được phân tích với 24 màu huỳnh quang, những nhiễm sắc thể bất
thường được đánh dấu mũi tên; (B) Những bất thường được làm rõ với số chỉ nguồn gốc
1.2.4.3. Ứng dụng trong nghiên cứu tiến hóa và phân loại sinh vật
So với các kỹ thuật vi sinh vật học truyền thống, kỹ thuật FISH cho thấy ưu điểm nổi bật trong các nghiên cứu xác định sự có mặt của vi sinh vật cũng như định loại chúng. FISH có thể được sử dụng trực tiếp trên mẫu nghiên cứu để xác định sự hiện diện và hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh. Phương pháp này cho kết quả nhanh chóng mà khơng địi hỏi các thao tác cấy chuyển và lựa chọn điều kiện nuôi cấy đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật, nhất là với những vi sinh vật chưa được định loại. Nhờ vậy, FISH được sử dụng nhiều trong lĩnh vực sinh thái học vi khuẩn, xác định vi sinh vật, với đầu dò thường được thiết kế ở trong vùng gen ARN ribosome 16S [14, 91]. Việc so sánh các trình tự ADN lặp lại bằng kỹ thuật FISH cũng cung cấp các bằng chứng về mối quan hệ tiến hóa giữa các lồi [91].
Ở Việt Nam, Viện Nghiên cứu Hải sản (Hải Phòng) cũng đã sử dụng phương pháp này để định loại nhanh hai loài tảo giáp độc hại là Alexandrium affine và Alexandrium pseudogonyaulax ở vùng biển nước ta [7]. Ngoài ra, một số báo cáo định loại vi sinh vật cũng đã được công bố. Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu cơ bản vẫn còn khá hạn chế.