Đầu dò được tổng hợp bằng phương pháp PCR trong đó thành phần phản ứng được bổ sung thêm Alexa Fluor® 568–5–dUTP (phát huỳnh quang màu đỏ) sao cho tỷ lệ dUTP : dTTP = 2:1. Trong phản ứng PCR, giai đoạn tổng hợp ở 72oC được cài đặt diễn ra trong 60 giây ở chu kỳ đầu tiên và tăng thêm 2 giây sau mỗi chu kỳ để tăng hiệu quả gắn dUTP (mang cấu trúc Alexa Fluor® 568 khá cồng kềnh). Sản phẩm sau khi điện di được quan sát dưới máy soi gel Cleaver UV Transilluminator mà không nhuộm Ethidium bromide, kết quả thể hiện ở Hình 17.
Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò
(–) Đối chứng âm; (1),(3) khuôn tổng hợp là vector chuyển gen; (2) khuôn tổng hợp là ADN hệ gen gà. Sản phẩm chạy ở giếng (3) được tổng hợp với dNTP bổ sung Alexa Fluor® 568–5–dUTP và khơng nhuộm Ethidium bromide trước khi điện di.
Kết quả điện di cho thấy chỉ có một băng duy nhất với kích thước 289 bp (xấp xỉ băng 300 bp của thang chuẩn) được khuếch đại khi sử dụng khuôn là vector
pLenti6/V5–DEST đã chèn gen IL–6 (giếng 1), ngồi ra khơng phát hiện được bất kỳ băng nào khác khi sử dụng khuôn là ADN hệ gen gà (giếng 2). Kết quả này chỉ ra tính đặc hiệu của cặp mồi được chúng tơi thiết kế. Bên cạnh đó, mẫu tổng hợp sử dụng Alexa Fluor® 568–5–dUTP thu được băng duy nhất có kích thước tương đương và độ sáng đủ quan sát bằng mắt thường mà không thông qua các thuốc nhuộm đặc hiệu (giếng 3), chứng tỏ sản phẩm đã được đánh dấu với cường độ huỳnh quang tương đối lớn (Hình 17). Sản phẩm này sau đó được tinh sạch bằng Kit Wizard® SV Gel & PCR Clean–Up System (Promega) để chuẩn bị cho những nghiên cứu tiếp theo.