Tên mồi Trình tự (chiều 5’-3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) PF1 TAACAAACTGCTGGACTACC 4238 PR1 CCCTAATCGTCTGCTGATAG PF2 GTGTTGGACTTGGGTGGAAG 2982 PR2 CCAGTACGTCTTCTAGCCTC PF3 GTGCTGGAAAGTGACATTGG 1420 PR3 CTAAGCATGGCTCTTCGCC PF4 TGCCCGTCTTCTCAAAGAGT 565 PR4 CACAGTAGATGTAGGCGCAG
3.2.2. Kết quả khuếch đại PCR gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 13 cho thấy các băng sản phẩm PCR của tất cả các cặp mồi đều sáng
bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này chứng tỏ số bản sao sản phẩm khuếch đại đã đạt đến lượng tiêu chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm này đều phù hợp với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, các giếng đkhơng có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực
hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm sau tinh sạch đã được gửi cho cơng ty 1stBASE để giải trình tự.
Hình 13: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen penton
3.2.3. Kết quả giải trình tự gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 14, các đỉnh tín hiệu giải trình tự đều rất rõ ràng và đạt độ phân giải cao.
Tín hiệu nhiễu nền rất thấp hoặc khơng có. Tổng độ dài trình tự chúng tơi đã giải được từ 4 cặp mồi PF1-PR1, PF2-PR2, PF3-PR3, và PF4-PR4 sử dụng trong nghiên cứu này là 4126 bp. Tuy nhiên, sau khi lược bỏ những trình tự khơng thuộc vùng mã hóa thì chiều dài gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam thu được là 1635 bp. Như vậy, độ dài chuỗi axit amin của các protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam là 545 axit amin. Kích thước này cũng tương tự so với trình tự đã cơng bố của HAdV-3 tham chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI. Chứng tỏ, chúng tôi đã giải thành cơng trình tự của gen penton của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam với độ tin cậy cao.
3.2.4. Kết quả so sánh trình tự mã hóa gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Sau khi thu được trình tự ADN hồn chỉnh của cả gen penton. Chúng tơi đã so sánh nó với trình tự genome tham khảo của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã trình tự là NC_011203.1. Thơng qua việc so sánh này, chúng tôi đã phát hiện được những biến đổi ở cả cấp độ ADN và axit amin của gen và protein penton. Các kết quả so sánh được biểu diễn trên phần mềm Bioedit (Hình 15), và được tổng hợp lại trong các Bảng 9.
Bảng 9: Các biến đổi trên gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu
STT Vị trí Nucleotide Axit amin biến đổi NC_011203.1 HAdV-3 Việt Nam
1 13998 A C I32L 2 14033 A G - 3 14141 C T - 4 14360 A G - 5 14377 C T T158I 6 14414 G A - 7 14437 T C I178T 8 14456 T C - 9 14471 G C - 10 14474 C T - 11 14525 G A - 12 14573 T C - 13 14576 C T - 14 14618 T A - 15 14654 A T - 16 14720 G A - 17 14750 C T - 18 14880 G A D326N 19 14900 C T - 20 15026 A G - 21 15038 T C - 22 15068 T C - 23 15098 C T - 24 15288 G A A462T
Như vậy, phần mã hóa của gen penton có tổng cộng là 24 các biến đổi ADN trên tổng chiều dài là 1635 bp. Trong đó có 5 biến đổi ADN dẫn đến thay thế axit amin. Từ đó, chúng tơi đã tính ra tỉ lệ biến đổi ở mức độ ADN của gen penton là 1,47%. Tương tự với cách tính như vậy, tỉ lệ số lượng axit amin bị thay thế trên tổng số biến đổi nucleotide của gen penton là 20,83%. Cuối cùng, tỉ lệ biến đổi axit amin trên tổng số axit amin của protein penton là 0,92%.
Để có cái nhìn rõ ràng hơn về vị trí của các biến đổi axit amin trên cấu trúc không gian của protein penton, và đánh giá được chi tiết hơn về những tác động của các biến đổi này có thể mang lại, chúng tơi thực hiện bước tiếp theo là xây dựng cấu trúc 3D mô phỏng của protein này.
3.2.5. Kết quả phân tích cấu trúc ba chiều protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với dữ liệu của ngân hàng dữ liệu protein, chúng tôi đã mô phỏng thành công cấu trúc 3D của protein penton của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Các biến đổi axit amin được thể hiện dưới dạng tinh thể trong phần mềm pyMOL. Có một biến đổi khơng được thể hiện lên hình là do phần mềm khơng xây dựng được phần cấu trúc mang biến đổi, đó là đầu N của protein penton.
Cấu trúc dự đoán của penton HAdV-3 Việt Nam được xây dựng dựa trên cấu trúc khn 4aqq.1.A [56], có độ tương đồng trình tự axit amin là 98,62%. Trên phần mềm pyMOL, chúng tơi thể hiện được vị trí của 4 trong 5 biến đổi axit amin (ngoại trừ I32L nằm ở đầu N, vì chương trình SWISS-MODEL chỉ dự đốn được cấu trúc của axit amin thứ 48 đến 542) (Hình 16C).
Hình 16: Protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam và các axit amin biến đổi A. So sánh trình tự axit amin protein penton, B. Nhìn từ bên ngồi, C. Nhìn ngang A. So sánh trình tự axit amin protein penton, B. Nhìn từ bên ngồi, C. Nhìn ngang
Hình ảnh biểu diễn cho thấy các biến đổi T158I, D326N và A462T nằm ở vị trí mặt trên protein penton, những biến đổi này có thể đã ảnh hưởng đến khả năng tương tác giữa penton và fiber. Trong đó, T158I có sự thay đổi lớn nhất về tính ưa nước do I có chỉ số H là 4,5 cao hơn rất nhiều so với -0,7 của T, làm cho vị trí 158 từ trung tính trở nên kỵ nước rất mạnh (Bảng 10). Tiếp theo, D326N đã tạo ra một sự thay đổi lớn về tính axit, vì D là 1 axit amin có tính axit mạnh bị chuyển thành N là 1 axit amin trung tính. Biến đổi A462T lại không thể hiện sự thay đổi rõ rệt nào về các tính chất, chỉ chuyển từ kỵ nước nhẹ (A) sang trung tính (T). Tuy nhiên, A462T là vị trí thuộc 1 chuỗi xoắn α nằm ở vị trí trung tâm của pentamer penton, vì vậy mà nó có nguy cơ làm thay đổi một phần cấu trúc penton, từ đó dẫn đến thay đổi khả năng liên kết giữa các monomer với nhau để tạo thành cấu trúc pentamer.