Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Chu kỳ (lần lặp)
Khởi đầu 98 30 1 Biến tính 98 20 40 Gắn mồi * 10 Kéo dài 72 ** Kết thúc 72 300 1 Bảo quản 20 ∞
*: Tính bằng cơng cụ online của nhà sản xuất dựa theo phương pháp nhiệt động học của Allawi và SantaLucia [2].
**: Thời gian kéo dài được xác định từ tốc độ tổng hợp của enzyme là 30 giây/1 kb.
2.2.4. Kỹ thuật điện di trên gel Agarose
Sau khuếch đại PCR, 3 µL mỗi phản ứng cùng với marker tương ứng (1 kb hoặc 100 bp) được điện di trên gel agarose 1%. Sau điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0.5 µg/mL trong vịng 10 phút. Cuối cùng, bản
gel được quan sát trên ánh sáng UV ở bước sóng 260-280 nm và chụp ảnh bằng hệ thống Alphaimager MINI.
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự
Những sản phẩm PCR đặc hiệu, đúng với kích thước lý thuyết của từng cặp mồi được chúng tôi tinh sạch bằng bộ sản phẩm MEGAquick-spinTM Total fragment DNA purification kit của hãng iNtRon, Hàn Quốc. Các thao tác được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Mục đích của việc tinh sạch sản phẩm PCR là để loại bỏ những thành phần thừa như: DNA polymerase, dNTPs, mồi, các thành phần muối trong dung dịch đệm; tạo điều kiện cho phản ứng giải trình tự diễn ra tốt hơn và cho ra tín hiệu rõ ràng hơn.
2.2.6. Giải trình tự ADN
Sản phẩm PCR sau tinh sạch được gửi đi giải trình tự tại cơng ty 1stBASE Malaysia với các hóa chất của BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing kit.
2.2.7. Phân tích trình tự ADN và protein
Sau khi nhận kết quả từ cơng ty 1stBASE, chúng tơi xử lý tín hiệu giải trình tự ADN bằng phần mềm Bioedit [25] để loại bỏ những đoạn trình tự khơng thuộc phần mã hóa protein. Tiếp theo, trình tự ADN của từng gen được so sánh với trình tự tham chiếu HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã số NC_011203.1. Thông qua so sánh, chúng tơi đã tìm ra những sai khác ở mức độ ADN dẫn đến các biến đổi axit amin của từng protein fiber, penton và hexon. Sau đó, trình tự ADN được dịch thành trình tự axit amin bằng công cụ Snapgene, sử dụng cho việc xây dựng cấu trúc mô phỏng của từng protein.
2.2.8. Phân tích cấu trúc ba chiều của các protein
Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với cơ sở dữ liệu protein PDB và trình tự axit amin của protein fiber, penton và hexon của HAdV-3 ở Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng được cấu trúc ba chiều mô phỏng của các protein. Sau đó, bằng phần mềm pyMOL, chúng tơi xác định được vị trí của những biến đổi axit amin của
từng protein trên cấu trúc ba chiều tương ứng. Cuối cùng, dựa trên vị trí và tính chất của những axit amin biến đổi, chúng tơi dự đốn những hậu quả liên quan tới sức sống, khả năng xâm nhiễm và độc lực của vi-rút HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein fiber của HAdV-3 tại Việt Nam 3.1.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam 3.1.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam
Chúng tôi đã thiết kế được 2 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu gen fiber. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại gen fiber được trình bày chi tiết trong