Hình 12: Đầu tương tác fiber của HAdV-3 tại Việt Nam và domain SCR1-2 của thụ thể CD46
A. So sánh trình tự axit amin protein fiber, B. Hướng nhìn từ bên ngồi vi-rút
Trong số 10 axit amin bị biến đổi, có 6 biến đổi khơng được thể hiện trên hình gồm: bốn biến đổi (E215Q, A222T, D223H, R316T) cũng nằm ở đầu tương tác của fiber nhưng ở vị trí khơng tương tác trực tiếp với thụ thể CD46, và hai biến đổi (S22N, S23L) nằm ở trục của protein fiber (phần mềm không xây dựng được cấu trúc). Bốn biến đổi còn lại (Q150E, S207L, H246D, M272T) nằm rất gần với domain SCR1-2 nên có khả năng lớn ảnh hưởng tới sự tương tác giữa đầu tương tác fiber của HAdV- 3 và thụ thể CD46 ở người. Vì vậy chúng tơi đã tổng hợp lại giá trị pI và chỉ số H của các axit amin trong 4 biến đổi này để tiện cho việc so sánh và đánh giá hậu quả (Bảng
7).
A
Bảng 7: Các biến đổi axit amin trên đầu tương tác fiber Vị trí Vị trí biến đổi Axit amin ban đầu Giá trị pI Chỉ số H Axit amin thay thế Giá trị pI Chỉ số H
Q150E Q (Glutamine) 5,65 -3,5 E (Glutamate) 3,08 -3,5
S207L S (Serine) 5,68 -0,8 L (Leucine) 6,04 3,8
H246D H (Histidine) 7,64 -3,2 D (Aspartic acid) 2,87 -3,5 M272T M (Methionine) 5,74 1,9 T (Threonine) 5,60 -0,7
Từ những khác biệt về giá trị pI và chỉ số H như trên, biến đổi Q150E sẽ làm thay đổi nhẹ sự tích điện tại vị trí 150 vì Q và E đều là axit amin ưa nước như nhau nhưng E có tính axit và tích điện âm, cịn Q là một axit amin trung tính. Tương tự, thay thế S207L sẽ làm tăng rất mạnh tính kỵ nước tại vị trí này vì độ chênh lệch chỉ số H là rất lớn giữa L (3,8) và S (-0,8). Tiếp theo là biến đổi H246D, dễ thấy H và D có chỉ số H tương đương nhau, nhưng trong khi H có tính bazơ nhẹ thì D lại có tính axit lớn nhất trong 20 axit amin, do vậy mà biến đổi này sẽ làm thay đổi rất lớn tương tác tại vị trí 246. Cuối cùng, biến đổi M272T cũng sẽ làm cho vị trí này thay đổi đáng kể tính kỵ nước do có sự khác biệt rõ ràng giữa 2 axit amin M (kỵ nước) và T (ưa nước).
Từ những phân tích trên, có khả năng cao là 4 biến đổi Q150E, S207L, H246D và M272T đã làm thay đổi liên kết giữa đầu tương tác fiber của HAdV-3 ở Việt Nam với thụ thể CD46 ở bệnh nhân. Sáu biến đổi cịn lại tuy khơng nằm ở vị trí tương tác với thụ thể nhưng cũng có khả năng chúng có ích cho vi-rút, hỗ trợ liên kết giữa 3 monomer fiber với nhau. Tóm lại, kết quả phân tích protein fiber đã chỉ ra khả năng tương tác của HAdV-3 ở Việt Nam với tế bào chủ đã có những khác biệt so với chủng HAdV-3 tham chiếu trên thế giới. Những sự khác biệt này có thể là sự tiến hóa thích nghi để HAdV-3 tăng cường khả năng xâm nhiễm và lây lan trong cộng đồng người dân ở Việt Nam.
3.2. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam 3.2.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Chúng tôi đã thiết kế được một bộ mồi gồm 4 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu đoạn gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam. Trình tự các mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại được trình bày chi tiết trong Bảng 8.
Bảng 8: Mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 ở Việt Nam
Tên mồi Trình tự (chiều 5’-3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) PF1 TAACAAACTGCTGGACTACC 4238 PR1 CCCTAATCGTCTGCTGATAG PF2 GTGTTGGACTTGGGTGGAAG 2982 PR2 CCAGTACGTCTTCTAGCCTC PF3 GTGCTGGAAAGTGACATTGG 1420 PR3 CTAAGCATGGCTCTTCGCC PF4 TGCCCGTCTTCTCAAAGAGT 565 PR4 CACAGTAGATGTAGGCGCAG
3.2.2. Kết quả khuếch đại PCR gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 13 cho thấy các băng sản phẩm PCR của tất cả các cặp mồi đều sáng
bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này chứng tỏ số bản sao sản phẩm khuếch đại đã đạt đến lượng tiêu chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm này đều phù hợp với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, các giếng đkhơng có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực
hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm sau tinh sạch đã được gửi cho cơng ty 1stBASE để giải trình tự.