Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein hexon của HAdV-3 tại Việt
3.3.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Chúng tôi đã thiết kế được 3 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại được trình bày chi tiết trong Bảng 11.
Bảng 11: Mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 ở Việt Nam
Tên mồi Trình tự (chiều 5’-3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) HF1 CTTAATGACTGTTGACGCTG 4274 HR1 GGATCAAAAAGGTAGCAGGT HF2 CTCTGGTATTAACGGCGTAG 3131 HR2 GTATGGATAATTGGCTGGGT HF3 GCTTAACTTGCTTGTCTGTG 1878 HR3 TCTGAGGTCATTTCCAAGGG
3.3.2. Kết quả khuếch đại PCR gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 17 cho thấy các băng sản phẩm PCR của tất cả các cặp mồi đều sáng
bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này chứng tỏ số bản sao sản phẩm khuếch đại đã đạt đến lượng tiêu chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm này đều phù hợp với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, các giếng khơng quan sát thấy có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm sau tinh sạch đã được gửi cho công ty 1stBASE để giải trình tự.
Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen hexon
3.3.3. Kết quả giải trình tự gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Nhìn vào Hình 18 có thể thấy các đỉnh tín hiệu giải trình tự đều rất rõ ràng và đạt độ phân giải cao. Tín hiệu nhiễu nền rất thấp hoặc khơng có. Tổng độ dài chúng tôi đã giải được từ 3 cặp mồi HF1-HR1, HF2-HR2, và HF3-HR3 sử dụng trong nghiên cứu này là 3906 bp. Tuy nhiên, sau khi lược bỏ những trình tự khơng thuộc vùng mã hóa gen thì chiều dài gen hexon thu được chỉ cịn 2835 bp. Như vậy, độ dài chuỗi axit amin của hexon của HAdV-3 tại Việt Nam là 945 axit amin. Kích thước này cũng tương tự so với trình tự đã cơng bố trước đó của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Chứng tỏ, chúng tơi đã giải thành cơng trình tự của gen hexon của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam với độ tin cậy cao.
3.3.4. Kết quả so sánh trình tự mã hóa gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Sau khi thu được trình tự ADN hồn chỉnh của gen hexon. Chúng tơi đã so sánh đó với trình tự genome tham khảo của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã trình tự là NC_011203.1. Thơng qua việc so sánh này, chúng tôi đã phát hiện được những biến đổi ở cả cấp độ ADN và axit amin của cả gen và protein hexon. Kết quả so sánh biểu diễn trên phần mềm Bioedit (Hình 19), và được tổng hợp lại trong Bảng
12.
Bảng 12: Các biến đổi trên gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu
STT Vị trí Nucleotide Axit amin biến đổi NC_011203.1 HAdV-3 Việt Nam
1 18489 C G - 2 18542 G C G42A 3 18594 C T - 4 18834 A G - 5 18838 G C G141R 6 18840 G A 7 19313 A G E299G 8 19321 A G N302D 9 19380 C A - 10 19395 C T - 11 19648 A G N411D 12 19670 C G T418R 13 19671 A G 14 19702 A G T429A 15 19733 C A A439D 16 19735 C A P440T 17 19750 A G T445A 18 19758 C A - 19 19818 T C - 20 19929 C T - 21 19953 T C - 22 20085 G A - 23 20103 G A - 24 20149 C A - 25 20202 G A - 26 20439 A G -
27 20529 T C - 28 20610 T C - 29 20694 G A - 30 20712 T C - 31 20856 C T - 32 20883 G A - 33 20892 A G - 34 20964 G A - 35 20970 C T - 36 20976 G A - 37 21012 T A - 38 21015 C G - 39 21042 G A - 40 21051 C G - 41 21067 A C M884L 42 21084 A G -
Như vậy, phần mã hóa của gen hexon có tổng cộng 42 biến đổi ADN trên tổng chiều dài 2835 bp. Trong đó, 11 biến đổi ADN dẫn đến thay thế axit amin. Từ đó, chúng tơi đã tính ra tỉ lệ biến đổi ở mức độ ADN của gen hexon của HAdV-3 tại Việt nam là 1,48%. Tương tự với cách tính như vậy, tỉ lệ số lượng axit amin bị thay thế trên tổng số biến đổi nucleotide của gen hexon là 26,19%. Cuối cùng, tỉ lệ biến đổi axit amin trên tổng số axit amin của protein hexon là 3 1,16%.
Để có cái nhìn rõ ràng hơn về vị trí của các biến đổi axit amin trên cấu trúc không gian của protein, và đánh giá được chi tiết hơn về những tác động của các biến đổi này có thể mang lại, chúng tôi thực hiện bước tiếp theo là xây dựng cấu trúc 3 chiều mô phỏng của protein này.
3.3.5. Kết quả phân tích cấu trúc ba chiều protein hexon của HAdV-3 tại Việt Nam Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với dữ liệu của ngân hàng dữ liệu protein, chúng tôi đã mô phỏng được cấu trúc 3D của protein hexon của HAdV-
3 gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Các biến đổi axit amin được thể hiện dưới dạng tinh thể trong phần mềm pyMOL.
Tìm kiếm cấu trúc khn bằng chương trình SWISS-MODEL, chúng chúng tơi tìm thấy 22 khn khác nhau, trong đó có khn 2OBE [41] có độ tương đồng cao nhất là 87.11%. Tuy nhiên, cấu trúc hexon này chỉ thể hiện được 1 cấu trúc trimer riêng lẻ chứ không thể hiện được sự liên kết giữa các cấu trúc trimer với nhau, hơn nữa, 2OBE là cấu trúc hexon ở lồi Chimpanzee Adenovirus. Vì vậy chúng tơi đã lựa chọn 5TX1 [71] (tương đồng 84,28%, HAdV-26) để làm khuôn xây dựng cấu trúc của hexon HAdV-3 ở Việt Nam.
Trên cấu trúc thể hiện bằng phần mềm pyMOL, 2 biến đổi G42A và M884L nằm ở vị trí mặt dưới của vỏ capsid, 9 biến đổi còn lại nằm ở mặt trên (Hình 20B). Vì hexon là protein chủ yếu tạo nên lớp vỏ của HAdV-3 và đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hệ miễn dịch nhận biết và bất hoạt HAdV thông qua nhận biết protein bề mặt này [47, 65], chúng tơi dự đốn 9 biến đổi ở mặt trên có ý nghĩa rất lớn giúp HAdV-3 trốn tránh hệ miễn dịch khi xâm nhiễm vào người Việt Nam. Độ chênh lệch giữa giá trị pI và chỉ số H của từng vị trí axit amin bị biến đổi được thể hiện trong
Bảng 13, cũng cho thấy các vị trí này có sự thay đổi lớn trong tính ưa nước và độ
phân cực. Đặc biệt là các biến đổi G141R, E299G, T418R, A439D có sự thay đổi mạnh cả giá trị pI và chỉ số H. Chỉ có biến đổi P440T là ít thay đổi nhất và gần như khơng có sự thay đổi tính chất nào giữa 2 axit amin P và T.
Hình 20: Protein hexon của HAdV-3 ở Việt Nam ở dạng monomer và các axit amin biến đổi
A. So sánh trình tự axit amin protein hexon, B. Hướng nhìn ngang hexon
Hình 21: Biến đổi G42A và M884L trên cấu trúc trimer hexon
A. Trimer hexon; B. 12 trimer hexon tạo thành 1 mặt cắt của vỏ capsid, những vị trí
liên kết giữa các biến đổi M884L được kí hiệu hình ngơi sao.
B A
Bảng 13: Các biến đổi axit amin trên protein hexon Vị trí Vị trí biến đổi Axit amin ban đầu Giá trị pI Chỉ số H Axit amin thay thế Giá trị pI Chỉ số H
G42A G (Glycine) 6,06 -0,4 A (Alanine) 6,11 1,8 G141R G (Glycine) 6,06 -0,4 R (Arginine) 10,76 -4,5 E299G E (Glutamate) 3,08 -3,5 G (Glycine) 6,06 -0,4 N302D N (Asparagine) 5,41 -3,5 D (Aspartate) 2,87 -3,5 N411D N (Asparagine) 5,41 -3,5 D (Aspartate) 2,87 -3,5 T418R T (Threonine) 5,60 -0,7 R (Arginine) 10,76 -4,5 T429A T (Threonine) 5,60 -0,7 A (Alanine) 6,11 1,8 A439D A (Alanine) 6,11 1,8 D (Aspartate) 2,87 -3,5
P440T P (Proline) 6,30 -1,6 T (Threonine) 5,60 -0,7 T445A T (Threonine) 5,60 -0,7 A (Alanine) 6,11 1,8 M884L M (Methionine) 5,74 1,9 L (Leucine) 6,04 3,8 Trong hai biến đổi nằm ở mặt phía trong của hexon, biến đổi M884L nằm ở vị trí tiếp xúc giữa các trimer hexon (Hình 21B). Tại vị trí này, axit amin L có chỉ số H là 3,8 (rất kị nước) đã thay thế cho M có chỉ số H là 1,9 (ít kị nước), cho thấy vị trí biến đổi này có thể đã làm tăng độ liên kết giữa các trimer hexon, giúp lớp vỏ bảo vệ của vi-rút có cấu trúc bền vững và ổn định hơn. Biến đổi cuối cùng - G42A nằm ở phần lõi, mặt dưới của hexon (Hình 21A), đây là vị trí bám của protein VI [30, 64], có chức năng quan trọng trong việc phân tách các protein tiền thân cần thiết cho hoàn thiện cấu trúc và xâm nhiễm của vi-rút. Axit amin G trung tính (chỉ số H là -0,4) bị biến đổi thành A kị nước (chỉ số H là 1,8), có thể đã giúp protein VI bám vào hexon ổn định hơn, từ đó tăng cường độc lực của vi-rút. Ngồi ra, kết quả của chúng tơi cũng chỉ ra rằng vùng trình tự axit amin tạo các cuộn xoắn α và nếp gấp β hình thành nên cấu trúc khung của hexon HAdV-3 ở Việt Nam rất bảo thủ, điều này thống nhất với những kết quả khác chỉ ra rằng cấu trúc hexon của HAdV-26, HAdV-5 và HAdV- 2 gần như trùng khớp với nhau, ngoại trừ một số vùng HVRs [48, 71].
Nhìn chung, đa số các biến đổi axit amin ở protein hexon nằm rải rác ở các vùng siêu biến (mặt ngồi vỏ capsid). Điều này có khả năng cao đã giúp HAdV-3 tiến hóa để trốn tránh hệ miễn dịch của bệnh nhân. Chỉ có hai biến đổi G42A và M884L được dự đốn là có khả năng tăng cường sức sống của độc lực của HAdV-3 tại Việt Nam.