A. So sánh trình tự axit amin protein penton, B. Nhìn từ bên ngồi, C. Nhìn ngang
Hình ảnh biểu diễn cho thấy các biến đổi T158I, D326N và A462T nằm ở vị trí mặt trên protein penton, những biến đổi này có thể đã ảnh hưởng đến khả năng tương tác giữa penton và fiber. Trong đó, T158I có sự thay đổi lớn nhất về tính ưa nước do I có chỉ số H là 4,5 cao hơn rất nhiều so với -0,7 của T, làm cho vị trí 158 từ trung tính trở nên kỵ nước rất mạnh (Bảng 10). Tiếp theo, D326N đã tạo ra một sự thay đổi lớn về tính axit, vì D là 1 axit amin có tính axit mạnh bị chuyển thành N là 1 axit amin trung tính. Biến đổi A462T lại không thể hiện sự thay đổi rõ rệt nào về các tính chất, chỉ chuyển từ kỵ nước nhẹ (A) sang trung tính (T). Tuy nhiên, A462T là vị trí thuộc 1 chuỗi xoắn α nằm ở vị trí trung tâm của pentamer penton, vì vậy mà nó có nguy cơ làm thay đổi một phần cấu trúc penton, từ đó dẫn đến thay đổi khả năng liên kết giữa các monomer với nhau để tạo thành cấu trúc pentamer.
Bảng 10: Các biến đổi axit amin trên protein penton Vị trí Vị trí biến đổi Axit amin ban đầu Giá trị pI Chỉ số H Axit amin thay thế Giá trị pI Chỉ số H
I32L I (Isoleucine) 6,04 4,5 L (Leucine) 6,04 3,8 T158I T (Threonine) 5,60 -0,7 I (Isoleucine) 6,04 4,5 I178T I (Isoleucine) 6,04 4,5 T (Threonine) 5,60 -0,7 D326N D (Aspartate) 2,87 -3,5 N (Asparagine) 5,41 -3,5 A462T A (Alanine) 6,11 1,8 T (Threonine) 5,60 -0,7 Ngoài ra, biến đổi I178T nằm ở mặt bên của penton, là vị trí tiếp xúc với hexon, tạo nên cấu trúc “nhóm sáu” (Group of Six – GOS) có chức năng liên kết các “nhóm chín” (Group of Nine – GON) với nhau [9, 30]. Biến đổi này có thể ảnh hướng rất lớn đến khả năng gắn của penton với hexon vì I là axit amin có tính kị nước lớn nhất bị thay thế bởi T trung tính (Bảng 10). Cuối cùng, biến đổi I32L là vị trí xảy ra nhiều tương tác và giữ chức năng quan trọng trong việc cuộn gập penton. Vị trí I32L thuộc đầu N, tương tác với cả hexon và protein IIIa; trong khi đó, các tương tác tại đầu N của penton được chỉ ra là rất quan trọng để giữ vững được cấu trúc vỏ capsid của HAdV [30, 71]. Là vị trí đứng trước P48, nên I32L cũng có thể gián tiếp hỗ trợ cho penton cuộn gập chính xác, hình thành nên cấu trúc Dodecahedron [56].
Như vậy, cả 5 biến đổi nhầm nghĩa trên gen penton đều dẫn đến những biến đổi axit amin nằm ở những vùng tương tác quan trọng giữa penton với fiber, hexon và protein IIIa. Dựa trên những thuộc tính của các axit amin bị biến đổi, chúng tơi dự đốn hậu quả có thể đã giúp HAdV-3 tăng khả năng sống sót và xâm nhiễm vào tế bào. Đặc biệt là biến đổi I32L nằm ở đầu N của penton có thể đã làm tăng số lượng cấu trúc Dodecahedron giúp virus tăng độc lực.
3.3. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein hexon của HAdV-3 tại Việt Nam 3.3.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam 3.3.1. Kết quả thiết kế mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Chúng tôi đã thiết kế được 3 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại được trình bày chi tiết trong Bảng 11.
Bảng 11: Mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 ở Việt Nam
Tên mồi Trình tự (chiều 5’-3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) HF1 CTTAATGACTGTTGACGCTG 4274 HR1 GGATCAAAAAGGTAGCAGGT HF2 CTCTGGTATTAACGGCGTAG 3131 HR2 GTATGGATAATTGGCTGGGT HF3 GCTTAACTTGCTTGTCTGTG 1878 HR3 TCTGAGGTCATTTCCAAGGG
3.3.2. Kết quả khuếch đại PCR gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 17 cho thấy các băng sản phẩm PCR của tất cả các cặp mồi đều sáng
bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này chứng tỏ số bản sao sản phẩm khuếch đại đã đạt đến lượng tiêu chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm này đều phù hợp với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, các giếng khơng quan sát thấy có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm sau tinh sạch đã được gửi cho cơng ty 1stBASE để giải trình tự.