Do nồng độ ADN khuôn thấp nên Hotstar Taq của Qiagen đã được chúng tôi sử dụng để nhân lên các phân đoạn cần thiết. Hotstar Taq là loại Taq chuyên dụng sử dụng cho các phản ứng PCR với nồng độ khn thấp, bởi loại Taq này có độ nhạy cũng như tính đặc hiệu cao. Đồng thời, do ADN tổng số có tỷ lệ đứt gãy cao, nên
chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen Cyt-b dài 1140bp bằng 2 phân đoạn ngắn là Cyt-b-1 (450bp) và Cyt-b-2 (750bp) để tăng khả năng nhân gen thành công. Với các
phân đoạn gen ND4, 16S, G-fibriniogen được nhân lên với kích thước từ 600bp –
800bp.
Với một số mẫu có nồng độ ADN quá thấp, dẫn đến kết quả phản ứng PCR (chúng tôi tạm gọi là PCR lần 1 sử dụng Hot Start Taq) có thể kém (băng điện di mờ) hoặc không cho kết quả PCR (khơng có băng điện di), chúng tơi tiến hành dùng
Hình 7. Ảnh điện di một số sản phẩm
nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp)
trên gel Agarose 1%, marker 100bp 450bp
Hình 8. Ảnh điện di một số sản phẩm
nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (750bp)
trên gel Agarose 1%, marker 100bp 750bp
sản phẩm PCR này làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR sử dụng Taq Polymerase (chúng tôi tạm gọi là PCR lần 2). Sau khi thực hiện lần thứ 2 này, băng điện di của
phản ứng PCR trên gel Agarose sáng rõ hơn. Thậm chí 1 số mẫu ở lần PCR thứ nhất khơng cho băng điện di thì ở lần PCR thứ 2 cho kết quả băng điện di sáng rõ (Hình 11).
Kết quả, với tổng cộng 58 mẫu ADN tổng số, chúng tôi đã nhân thành công 58 mẫu với gen Cyt-b. Dựa trên dữ liệu của 58 gen Cyt-b thu được, chúng tơi đã có kết quả bước đầu về phân loại các loài Mang ở Việt Nam. Qua kết quả bước đầu thu
được (sẽ được bàn kỹ hơn ở mục 4), chúng tôi lựa chọn và tiến hành nhân gen thành công 13 mẫu đối với phân đoạn gen ND4, 4 mẫu đối với gen 16S, 12 mẫu đối với
Hình 9. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bpA
600bp
Hình 10. Ảnh điện di một số sản phẩm
nhân phân đoạn gen G-fib (600bp) trên gel garose 1%, marker 100bp
600bp
(a) (b)
Hình 11. Điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2
(a). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp.
(b). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 2 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp.
các mẫu đại diện cho nhánh mà nó đại diện, và sản phẩm PCR của gen Cyt-b cho kết quả tốt. Tuy vậy, trong 13 mẫu lựa chọn để tiến hành nhân gen, có 1 mẫu chúng tôi không nhân gen thành công đối với gen G-fib. Đối với gen 16S, gen này phục vụ mục đích là xác định các mẫu thu được là của loài Mang Roosevelt (loài này cho đến thời điểm chúng tơi tiến hành nghiên cứu chỉ có 1 trình tự gen 16S duy nhất trên ngân hàng gen NCBI là AF108031), do đó, đối với gen này, chúng tơi chỉ nhân lên với 4 mẫu Mang được cho là loài Mang Roosevel; các gen 16S của các loài khác
chúng tơi sử dụng gen chuẩn của lồi có được qua ngân hàng gen NCBI. Kết quả sản phẩm PCR cho băng điện di lên đúng kích thước của gen cần nhân, độ sáng các băng tương đối tốt, đủ để thực hiện phản ứng giải trình tự (Hình 7,8,9,10).