: Nhiệt độ cột
G ỉ6: Polyethylen glycol có phân tứ lượng khoảng 15000 2: Nhựa dimethvlpolvsiloxan.
PHỤ LỤC 10 DƯỢC Đ1ÉN VÍỆT NA M
Bàng ỉ - Khối lượng mầu chá phẩm dùng thử nghiệm Tổng hàm lượng
EPA và ĩ)HA (%) 30-50 50-70 70 - 90
Khối lưọng mẫu chế phấm dùng thừ nghiệm (g)
0,4 - 0,5 0,3 0,3 0,25
B. Áp dụng với chế phẩm chứa acid omega-3 ờ dạng triglycerid: Lấv 2,0 ml dung dịch thu được ờ phép thử A vào ổng thủv tình thạch anh có nắp xốy dung tích thích hợp, bay hơi dung mõi den khơ dưới dịng khi ni trogen
(77). Thêm 1,5 ml cỉung dịch natri hvdroxvd (77) 2 % trong methanoỉ (TT), thổi khí nilrogen, nắp kín bang nắp đậy có có bao lớp polytetrafluorocthylen, lắc đều. Đun trên cách thùy trong 7 min, để nguội. Thêm 2 ml dung dịch Ị)i)ron tricỉorid trong methanoì (77), thơi khí ni trogen (77), nắp kín, lấc nhẹ. Dun trên cách thủy trong 30 min. Đe nguội tới 40 - 50°c, thêm 1 ml trimethyỉpentcữĩ (77), nắp kín, lắc mạnh ít nhất 30 s. Ngay lập tức, thêm 5 ml dung dịch natri cỉorid bão hịa (77), thổi khí ni trogen (Tí), nảp kín, lẳc kỹ trong ít nhất 15 s, Iv tâm 3000 r/min trong 5 min, hoặc để tách lớp. Chuyến lớp trimcthylpentan (lớp trên) sang lọ thủy tinh khác, phàn còn ỉại (lớp dưới) được chiết với 1 ml trimethyỉpentan (TT) thêm một lần nữa. Gộp các dịch chiết trimethyỉpentan. Rửa dịch chiết trimcthylpentan với nước hai lần, mỗi lẩn 1 ml, sau đỏ làm khô dịch chiết trimethylpentan bang natri Sulfat khan (77) được dung dịch tiêm sắc ký. Chuẩn bị 3 dung dịch thử,
Dung dịch thử (h): Hòa tan 0,300 g ché phẩm bàng dung dịch hutvỉhydroxytoỉuen (TT) 0,005 % trong
trimethyỉpc.ntan (TT) vả pha loãng thành 10,0 mỉ bàng cùng dung môi. Tiếp tục các bước tương tự như chuẩn bị dung dịch thử (a).
Dung dịch đối chiếu (a}): Hòa lan khoảng 70,0 mg chuẩn nội và 90,0 mg acid eicosapentacnoic cthyl ester chuẩn trong dung dịch butyỉhydroxytoỉuen (77) 0,005 %
trong trimethylpentan (77), pha loằng thành 10,0 ml hàng cùng dung mơi. Có thể đun nóng nhẹ (tới 60 °C) để hòa tan chn nội,
Dung dịch đối chiếu (tì2): Hịa tan khoảng 60,0 mg acid docosahexaenoic ethyl ester chuẩn và 70,0 mg chuẩn nội trong dung dịch butyỉhydroxyioluen (77) 0,005 % trong
trimethyỉpentan (77), pha loãng thành 10,0 ml bầnc cùng dung mơi. Có thể đun nóng nhẹ (tới 60 °C) đe hòa tan chuẩn nội.
Chuẩn bị dung dịch đối chiếu («,) và (a2)theo các bước như mơ tà tại mục A cùa phần D ung dịch thử (a) nếu kiểm tra chế phẩm chứa aciđ omega-3 ờ dạng cthyl estc; tiếp tục theo các bước mô tả tại mục B cùa phần Dung dịch thử (a) nếu chế phẩm chứa acid omega-3 ở dạng trigiycerid. Chuẩn bị 3 dung dịch dối chiếu dổi với mồi mầu chế phẩm cân ki ém tra.
Dung dịch dối chiểu (bị: Hòa tan 0,3 g methyỉpaỉmitat (TI). 0,3 g methyỉ stearat (Tỉ), 0,3 g methyì arachidat
(77; and 0,3 2 methyỉ behenat (77) trong dung dịch
buryỉhydroxytolucn (77) 0,005 % trong trỉmethylpentan
(77), pha lỗng thành 10,0 ml hàng cùng dung mơi.
Dung dịch đối chiếu (c); Hòa tan khoảng 55,0 mg acìd docosahexaenoic me t hy Ị ester (77) và khoang 5,0 mg
tìCĩd tetrưco.s-ỉ5-enoic mc.thyl ester (77) trong dung dịch
buỉylhydroxytnỉuen (77) 0,005 % trong trimeỉhyỉpentan
(77;. pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi.
Diều kiện sắc kỷ
Cột mao quản bàng silica nung chày, chiều dài ít nhất 25 m, đường kính 0,25 mm. được phù lóp phim macrogol 20000 đày 0,2 pin.
Khí mang: ỉĩydrogen (77) hoặc heỉi dùng cho sắc ký khí (77). Tốc độ dịng: 1,0 ml/min.
Dctector ion hóa ngọn lừa Thổ tích tiêm: 1 pl. tiêm 2 lần.
Tỳ lộ chia đòng 1: 200. Nếu hệ thống sắc ký sừ dụng chế độ khơng chia dịng, các dung dịch thừ và đối chiểu phài được pha lỗng 200 lẩn bằng dung dịch butyỉhydroxytoỉuen (ÍT)
0,005 % trong irimethxỉpentan (Tí) trước khi ticm sắc ký. Chương trình nhiệt độ:
Thịi gian Nhiệt độ
(min) (°C) Cột 0 - 2 170 2 - 25,7 170 —* 240 25.7 -2« 240 Buồng ticm Ị 250 Detector 270 Tính phù họp hộ thống:
Trên sắc ký đồ thu được cùa dung dịch đổi chiếu (b), phần trăm diện tích của các pic tăng dần tương ứng với các chất sau: methyl pal mi tat, methyl s tear at, methyl arachidal, methyl behenat. Phần trăm diện tích của pic methyl pa Imitat vù pic methyl bchenat khác nhau không quá 2,0 %.
Độ phân giãi: Trên săc kv đô thu được của dung dịch đôi chiếu (c). độ phân giải giữa pie của acid docơsahexaenoat mcthvl ester và acid ictracos-15-enoic methyl ester không nhỏ hơn 1,2.
Trên sắc kỷ đồ cùa dung dịch thừ (a), pic của methyl tricosanoat và bất kỳ pic cùa acid hencicosapentaenoie methyl ester hoặc ethyl ester (C21:5) khi so sánh với sắc ký đồ cùa dung dịch thử (b) phải cho thấy sự tách biệt rõ (nếu không phải dùng hệ số hiệu chỉnh).
Tính hàm lirựng phan trăm của EPA và D IIA theo công thức sau:
¿X*— ‘ A x ) X mI X mí rX - — -1
tnx ì A¡ A Kr IU' xCxỉOO
D ư ợ c Đì ẺN VIỆT NAM V PHỤ LỤC 10 Trong đó:
111, là khối lượng chuẩn nội trong đung dịch thừ (a), lính bằng mg;
m2 là khối lượng chế phẩm trong dung dịch thử (a), tỉnh bằng mg;
mx -Ị ỉà khối lượng chuẩn nội trong dung dịch đổi chiếu (aj) (định lượng EPA) hoặc trong dung dịch đôi chiêu (a2) (định lượng DMA), tính bằng mg;
f là khối lượng acid eỉcosapcntaenoic ethyl cster cliuẩn trong dung dịch đổi chiếu (a,) hoặc acid đocosahexaenoic ethyl esler chuẩn trong dung dịch đối chiếu (a->), tính bằng tng;
Ax lả diện tích pic cùa acid eicosapentaenoic ester hoặc acid docosahexaenoic ester trong sắc ký đồ cùa dung dịch thử (a);
Axr là diện tích pic của acid eicosapentaenoic ester trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a,) hoặc acid docosahexaenoic ester trong sắc ký đồ của dung dịch đổi chiếu (a2);
Ai là diện tích pic chuẩn nội trong sắc ký đồ của dung dịch thừ (a);
Ax 3 là diện tích pic chuân nội trong sắc ký đồ dung cùa dịch đối chiếu (aj) (định lượng EPA) hoặc trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a2) (định lượng DHA);
c là hệ số chuyển đổi giữa dạng ethyl cster và dạng triglycerid: c = 1,00 đổi vời ethyl ester; c = 0,954 đổi với EPA; c = 0,957 đổi với DI1A.
Aciíl omcga-3 tồn phần
Xcm sắc kỷ đồ cùa acid omega-3 toàn phàn trong dầu cá trong Hình 10.21.
ITr kết quả định lượng EPA và DHA, tỉnh hàm lượng phần trăm cùa acid om.cga-3 tồn phần theo cơng thức sau:
EPA+ĐHA +Án.s(EPA +DHA) A-EƯA + Á-DHA
Trong đó:
EPA là hàm lượng phàn trăm cùa EPA; DHA là hàm lượng phần trăm cùa DHA;
An.Ị tổng diện tích của các pic CT8:3 11-3, 0 8 : 4 n-3, C20:4 n-3, 0 2 1 :5 Ĩ1-3 and C22:5 n-3 ester trong sắc ký đồ cùa dung dịch thử (b);
A [ .ị»a là diện tích pic cùa EPA cster trong sắc ký đồ của dung dịch thử (b);
Adha là diện tích pic của DHA cster trong sắc ký đồ của dung dịch thử (b).
3 .0 6 :1 n-7 6. 0 8 :1 n-9 9. 0 8 : 3 11-3 12. C?.0:ln-9 14. C20:4 n-6 17. C22:) n-11 20. 022:5 n-6