: Nhiệt độ cột
G ỉ6: Polyethylen glycol có phân tứ lượng khoảng 15000 2: Nhựa dimethvlpolvsiloxan.
PHỤ LỤC 10 DƯỢC ĐIÊN VIỆT NAM
Điều kiện sắc ký:
Cột Làm sạch: Cột kích thước (30 cm X 4,6 mm) được nhoi pha tĩnh B (5 pm hoặc 10 pm) sử dụng pha động A. Cột phân tích: Cột kích thước (25 cin X 4,6 mm) được nhồi pha tình A (5 pm hoặc 10 pm) sừ dụng pha dộng B. Tốc độ dòng: 1 ml/min.
Dctcctor quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tỉnh phù hợp của hệ thong đổi với cột làm sạch:
Lấy chỉnh xác 5,0 mi dung dịch chuẩn vào binh cầu đáy tròn nối với ống sinh hàn hồi lưu, thêm 2 hoặc 3 tinh thể butyl hydroxytoỉuen (Tĩ). Thay thể khơng khí bằng nitrogen, đun nóng trong cách thủy duy trì ử nhiệt độ 90 °c trong ánh sáng dịu dưới khí nitrogen trong 45 min để thu được dung dịch có chửa vitamin D và tiền vitamin D. Làm lạnh và thêm 10,0 mỉ dung dịch chuân nội, lắc đều và bốc hcri bằng cất quay chân không ờ nhiệt độ không quá 40 °c. Làm lạnh dưới vòi nước và dưa mtrogen vào đủ đô phục hồi áp suất không khi. Hòa tan ngay can trong 10 mỉ hôn họp methanol - acetonitril (I : 1) và lăc đêu.
Tiêm 500 pl dung dịch này vào cột làm sạch. Săc ký đơ có một pic có thời gian lưu khoảng 5 min đến 9 min tương ứng với pic của hồn hợp gồm vitamin D, tiền vitamin D vả A4,6-cholc$tadienol được tách khỏi các chât khác. Điêu chinh ti lệ nước hoặc tốc độ dòng nếu cần (xem pha động A).
Kiêm tra tỉnh phù hợp cùa hệ thông đơi với cột phân tích:
Cân khoảng 100 mg chất chuẩn thừ độ thích hợp hệ thong của định Ỉưựỉĩg vìtamin D vào bình định mức dung tích
100 ml. hịa tan và pha loãng đến vạch bằng hồn hợp toỉuen - pha động B (5 : 95) và lắc đều. Đun hồi lưu một phần dung dịch này ờ 90 °c trong 45 min va làm lạnh, thu được dung dịch thừ độ thích hợp hệ thống của cột phân tích. Tiêm dung dịch thừ độ thích họp hệ thống của cột phân tích 5 làn: Thời gian lưu tương đòi ỉà khoảng 0,4 với pre-cholecalciferol, 0,5 với trans-cholecalciferol và 1,0 với cholecalciíerol. Độ phân giải giữa pic trans-cholecalciíerol và pre-choleca!ciferoỉ khơng nhỏ hơn 1,0 và độ lệch chuẩn tương đôi cùa đáp ứng pic cholecalciferol không quá 2,0 %.
Hiệu chuân hệ số đáp t'mg cùa viỉamin D: Lấy chính xác 4,0 ml đung dịch chuân và 10,0 ml dung dịch chuân nội vào binh định mức đune tích 100 ml, pha lỗng đến vạch với pha động B và lắc đêu đè thu được dung dịch chuẩn làm việc. Bảo quàn dung dịch chuẩn làm việc ừ nhiệt độ không quá 0 °c (giữ phán chưa dùng cho tiến hành định lượng). Tiêm 200 gỉ dung dịch chuẩn làm việc vào cột phân tích và đo đáp ứng pic của vitamin D và A4'6-cholestađienol. Thời gian lưu tương đối của Á4'6-cholestadienol là khoảng 1,3. Tính tốn hệ số đáp ứng, FD, bàng cơng thức sau:
Trong đó:
b D ~ Cs Rs X CR
c s va C R là nồng độ tương ứng của vitamin D và A‘1Ãcholestadieno] trong dung dịch chuẩn làm việc (gg/ml). Rs làti sô đáp ứng pic của vitamin Dđôi vcViA4 6-cholestađienol.
Hiệu chuân hệ so đáp ứng của tiền vitamin D: Lấv chính xãc 4 ml dung dịch chuẩn vảo bình cầu đáy trịn nổi
với ống sinh hàn hồi lưu, thêm 2 hoặc 3 tinh thỏ hutyỉ hydroxytoỉuen (7 7 ). Thay thế khơng khí bằng nitrogen, đun nóng trong cách thủy duy trì ở nhiệt 90 ° c trong ánh sáng dịu và dưới khí nitrogen trong 45 min để thu dược dung dịch có chứa vitamin D và tiền vitamin D. Làm mát và sừ dụng pha động B để chuyên toàn bộ dung dịch trên vào binh định mức dung tích 100 ml có chừa 10,0 ml dung dịch chuẩn nội, pha loãng đến vạch với pha dộng B và lắc đều, thu được dung dịch hỗn họp làm việc.
Tiêm 200 pl dung dịch hỗn họp làm việc vào cột phàn tích và đo đáp ứng pic của vitamin D, tiền vitamin I) và À4’6~cholestadienoỉ. Tính tốn nồng độ c s (pg/ml) cùa vi tam in D trong dung dịch hồn hợp làm việc (đã đun nóng) bàng công thức:
C‘s - Fị)x Cr x R ’s
Trong đó:
CR là nồng độ cùa A4'6-c,holcstadicnol (pg/ml);
R's là tỉ số đáp ứngpic cùa vitamin D đối với A4’6-cholestadienol. Tinh tốn nồng độ, C/W. (pgrìĩìl), cùa tiền vitamin D trong dung dịch hỗn hợp làm việc bàng cóng thức:
c '¡‘R E - c s ~ C’s
Tính tốn hệ số đáp ứng, FpRE, đối với tiên vitamin D bàng công thức:
T PREh ọ X R s x 67 P X E
R P R E x c s
Trong đó:
R'pre là tỉ số đáp ứng pic của tiền vitamin D đối với À4-6-cholestadienoi.
(Chú ý: Giá trị cùa Fpup được xác định trùng lặp ờ nhímg ngày khác nhau có thể sừ dụng trong cả quy trinh này).
Tiến hành sắc kỷ: Tiêm 500 pl dung dịch thừ vào cột làm sạch và lây phân rửa giải trong khoảng thời gian tương ứng 0,7 đen 1,3 thời gian lưu tương đối của pic vitamin E) hỗn họp (xem phần thử độ thích họp hệ thống của cột làm sạch) vào một bình cầu đáy trịn. Thêm 50 pl dung dịch butyl hydroxvtoỉuen (Tí), ỉ ắc đều và bay hơi trong chán không đèn khô bủng cat quay chân kháng ở nhiệt độ không quả 40 °c. Làm mát dưới vòi nước và đưa nitrogen vào đù đê phục hoi áp suất khơng khí. Hịa tan ngay cắn trong 5,0 ml hỗn hựp to ỉ ưe n - pha động H (5 : 95). Tiêm 200 pỉ dung dịch này vào cột phân tích và đo đáp ửng pic cùa vitamin D, tiền vitamin D và A4-6-cholestadienoỉ. Tinh toán nông độ cùa cholecalcifcrol (CV7H44O) hoặc ergocalciterol (C2XH44O) bằng công thức sau:
(R"r> x F)) + R" PRE x bphe)C" Ịỉ
Trong đó:
R"d là tỉ số cùa đáp úng pic của vitamin D đổi với A4'6-cholestadieno!;
R" PRE là tỉ SO đáp ứng pic cùa tiền vitam in D đổi với A4’ố-cholestadicnol;
C 'R là nong độ của A^-cholesíadienol trong dung dịch Ihử (ỊLig/ĩ111).
Phưong pháp 2: Phương pháp hỏa học
Quy trình sau đày đưực áp dụng cho dinh lượng vitamin D trong các chê phâm thc.
Hóa chất và thuốc thử đặc biệt
Đất sét dù mị cho sac kỷ (TTị): Đắt sét dùng cho sắc kv (Tỉ') có hàm lượng nước từ 8,5 % đến 9,0 % (sử dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô).
Ether dầu hỏa (TT,): Dùng ether dầu hỏa (77), nếu cần chưng cất lại, đáp ứng thêm yêu cầu sau đây:
Tinh khỉẻt quan {Ị phô'. Do độ hâp thụ (Phụ lục 4.1) của che phâm ở bước sóng 300 nm, dùng khơng khí làm mẫu trắng, độ hâp thụ không được quá 0,070.
Ethylen cỉorid (TTj): Ethylen cỉorid (TT) tinh chế qua cột silica gel (74 pm đến 850 um).
Dung dịch bun'! hydroxytoỉuen (TT¡ì: Hịa tan 10 mg butyl hydroxytoluen (TT) trong 100 ml ethanol 96 % (TT). Pha mới dung dịch hàng ngày.
Ether (TT2): Sử dụng ether (TT) mới cất, bò đi 10 % dịch cat đầu và cuối.
Thuốc thử tạo màu
Dung dịch A : Chuvẻn hết toàn hộ 113 g antimony tricỉorid (TT) tinh thế khơ có cliíra sẵn trong lọ mới chưa mở vào bình nón có chứa 400 ml ethylen florid ( TTị). Thêm khoảng 2 g nhôm oxvd khan (77), lấc đều và lọc qua giấy lọc vào bình định mức thủy tinh trong, dung tích 500 ml. Pha loãng thành 500 ml với ethyỉen cỉorid (TTi) và lắc đều. Đo độ hẩp thụ (Phụ lục 4.1 ) của dung dịch này ở bước sóng 500 nm, trong cốc đo 20 mm, dùng dung dịch ethylen cỉorỉd (TTị) làm mầu trang, độ hấp thụ đo được không được quá 0,070.
Dung dịch B: Lắc đều trong hốt 100 ml acetyl florid (TT)
với 400 ml et hy len d o r id (TTi).
Thuốc thử tạo màu: Lắc đều 45 ml dung dịch A và 5 ml dung dịch B. Bảo quản trong lọ kín và sử dụng được trong vòng 7 ngày, nhưng nếu thuốc thử xuất hiện màu thì bỏ đi.
Phương pháp sắc kỷ cột
Chuẩn bị các cột sắc kỷ:
- Cột thứ nhất: Chuẩn bị sắc ký cột đi xuống gồm một cột sắc ký cỏ đường kính trone 2,5 cm và dài khoảng 25 cm và được thu nhò lại tới đường kính 8 mm trong khoảng cách 5 cm từ đàu cuối của ống, đặt một dĩa thủy tiiứi xốp có lồ xốp lớn hoặc một miếng nhỏ bông thủy tinh ngay trên điểm thắt này. Phàn thu nhò này cỏ thê lắp một khóa nhựa bên trong.
Cho khoảng 125 ml isooctan (TT) vào một chai miệng rộng, nút xoáv, thêm 25 g đát Sìỉic dùng cho sác ký (TT),
lắc đến khi tạo thảnh bột nhão. Thêm tửng giọt và lắc đều mạnh 10 ml ¡xdyethyỉen g lyco l 600 (77). Đậy nút chai và lắc mạnh trong 2 min. Rót một nừa lưtmg bột nhão vào cột sắc ký và de lắng. Sau đó áp dụng hút chàn không nhẹ nhàng và thêm phần còn lại cùa bột nhão (thêm từng phần nhỏ một), nhỏi từng phàn bằng một ổng pit tông hỉnh đĩa 20 nun. Khi bề mặt ran bình thành, bị chán khơng và thêm khoang 2 ml isooctan (77).