CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.4. Nội dung 4 Nhân rễ bất định
Sử dụng các rễ đơn 20 ngày tuổi làm vật liệu nuôi cấy cho nhân rễ bất định. Tiến hành khảo sát chất ĐHST (NAA/IBA) ảnh hưởng đến sự phân nhánh rễ; ảnh hưởng của nồng độ đường, khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối rễ. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian.
Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu
TN 1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khống đến sự tạo phơi trực tiếp từ mô lá
TN 2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
TN 3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
TN 4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
TN 6. Trồng cây con ở chậu đất
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
TN 7. Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (10 x 10 mm) TN 5. Tạo cây con in vitro hồn chỉnh từ phơi vơ tính
TN 8. Tạo phơi từ mô sẹo nuôi cấy mảnh lá (10 x 10 mm) trên mơi trường đặc
Quan sát hình thái cụm tế bào/cụm mơ ni lỏng lắc
TN 10. Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm) TN 11. Tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
NỘI DUNG 1 Tạo phơi vơ tính
TN 13. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự tạo phôi thứ cấp
V
ậ
t l
iệ
u
TN 9. Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trong môi trường lỏng
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi trường đặc
TN 14. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
TN 17. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
NỘI DUNG 2 Nhân phơi vơ tính
TN 15. Ảnh hưởng của kích thước phơi ni cấy đến sự tạo phôi thứ cấp
TN 18. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp.
TN 16. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
TN 19. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
Nhâ n phô i t ro ng m ôi t rư ờ ng lỏ ng
TN 12. Nhân phôi trên môi trường đặc
T ạ o ph ơ i v ơ t ính t rự c tiế p t ừ m ơ lá T ạ o ph ơ i v ơ t ính g iá n t iế p qu a m ơ sẹ o m ả nh lá
T ạ o r ễ b ất đ ịnh t rự c t iế p từ m ô lá
TN 20. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
TN 22. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mơ lá
Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá
TN 23. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi in vitro của đốt thân cây vườn ươm
TN 24. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi của đốt thân cây in vitro
TN 25. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phơi vơ tính
NỘI DUNG 4 Nhân rễ bất định
TN 26. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ
TN 27. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
TN 28. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
TN 29. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian T ạ o r ễ b ất đ ịnh từ ch ồ i V ậ t li ệ u
TN 21. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
NỘI DUNG 3 Tạo rễ bất định
2.3. Nội dung 1. Tạo phơi vơ tính
2.3.1. Tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá
2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và mơi trường khống đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
Để khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của loại auxin với nồng độ thích hợp và mơi trường khống đến sự phát sinh phơi trực tiếp từ mảnh lá, tiến hành bố trí thí nghiệm theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST với các mức nồng độ khác nhau; yếu tố về môi trường khống với 4 loại mơi trường.
Vật liệu ni cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Mơi trường ni cấy là ½MS, MS [105], B5 [106] và SH [107] bổ sung loại auxin riêng lẻ (NAA hoặc IBA) ở các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 mg/L), có chứa 30 g/L đường (sucrose). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, tiến hành cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu tạo phôi tại thời điểm 60 NSC.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
Cắt dọc phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) thành lát mỏng bằng dao lam, ngâm vi phẫu vào nước javel đến khi mẫu trắng (loại bỏ nội chất tế bào), rửa sạch mẫu bằng nước cất. Sau đó, ngâm vi phẫu trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút (loại bỏ javel trước khi nhuộm). Thực hiện nhuộm kép vi phẫu bằng thuốc nhuộm son phèn - lục iod trong 15 phút, rửa sạch mẫu [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Chỉ tiêu theo dõi: Các dạng hình thái của phơi vơ tính (dạng phơi cầu, phơi tim, phôi thủy lôi, phôi dạng hai lá mầm)
2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
Nhằm xác định nồng độ BA tối ưu kết hợp với loại auxin có nồng độ thích hợp đến cảm ứng tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá.
Vật liệu ni cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm
Môi trường nuôi cấy là môi trường khống có loại auxin với các nồng độ có tác động tích cực đến sự hình thành phơi (kế thừa kết quả từ thí nghiệm 2.3.1.1) và có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,25; 0,5; 1mg/L), 30 g/Lsucrose. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về nồng độ của loại auxin với các mức nồng độ tác động tích cực đến tạo phơi (kết quả thí nghiệm trên), yếu tố về nồng độ của
BA (có 4 mức nồng độ). Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.
2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá trực tiếp từ mô lá
Khảo sát nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng thích hợp đến cảm ứng tạo phơi. Mơi trường ni cấy được sử dụng là mơi trường khống có nồng độ của loại auxin (NAA/IBA); nồng độ BA (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên) có bổ sung sucrose với các nồng độ khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L) và nuôi mẫu ở điều kiện chiếu sáng/tối. Ở điều kiện chiếu sáng, mẫu đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, chiếu sáng 12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4.000 lux; ở điều kiện tối mẫu đặt trong điều kiện tối hoàn toàn.
Vật liệu ni cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố sucrose với 4 mức nồng độ khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L), yếu tố điều kiện chiếu sáng với 2 mức sáng (4.000 lux)/tối. Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.
2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
Các điều kiện tối ưu của thí nghiệm 2.3.1.3 được áp dụng làm mơi trường ni cấy có bổ sung nước dừa với các tỷ lệ khác nhau 0, 5, 10, 15, 20% (v/v); để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá.
Vật liệu ni cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận tại thời điểm 60 NSC gồm tỷ lệ mẫu tạo phơi (%); số phơi/mẫu. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố.
2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hồn chỉnh từ phơi vơ tính
Nhằm xác định mơi trường ni cấy thích hợp để tạo cây con in vitro hồn chỉnh, từ đó tạo cây con có thân, bộ lá, rễ tốt phục vụ việc trồng cây ra chậu đất.
Vật liệu ni cấy là các cây con có thân cao ~ 1 cm, đã có lá thật 3 – 4 mm (nguồn gốc từ phơi vơ tính).
Tách các cây con, ni cấy trên các đĩa petri có chứa 30 mL mơi trường ni cấy là MS hoặc ½MS, có chứa 20 g/L sucrose, khơng bổ sung chất ĐHST. Cấy 5 cây con/đĩa với 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát hình thái cơ bản,
thu thập số liệu về các chỉ tiêu theo dõi sau cấy 90 ngày. Tại thời điểm 90 NSC tiến hành đo đếm các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá/cây, số rễ/cây; chiều dài rễ (mm): được xác định từ gốc rễ đến chóp rễ; quan sát hình thái cơ bản.
Sử dụng mơi trường tốt nhất của thí nghiệm làm mơi trường ni cấy tạo nguồn cây con in vitro khỏe mạnh. Sử dụng các cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính như trên cấy vào bình tam giác chứa 50 mL môi trường nuôi cấy, cấy 3 cây/bình, 10 bình/lần lặp lại, lặp lại 3 lần. Sau 3 tháng thu các cây con để trồng ra chậu đất ở vườn ươm. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
Các cây con 3 tháng tuổi được ni cấy trong bình tam giác (từ kết quả thí nghiệm trên), lấy ra khỏi bình tam giác, rửa sạch agar, bảo quản và đảm bảo độ ẩm tránh mất nước cho cây, sau đó được trồng ra chậu (có Ø ~ 20 cm) chứa đất sạch thương hiệu Tribat (Cty TNHH Cơng nghệ sinh học Sài Gịn Xanh, TP. HCM). Các chậu cây được đặt trong vườn ươm, trồng 1 cây con/chậu, 10 chậu/lần lặp lại, 3 lần lặp lại, ghi nhận tỷ lệ sống (%) và hình thái cơ bản của cây con ở thời điểm 3 tuần sau trồng.
Tỷ lệ sống (%) = (Số cây sống/số cây trồng) x 100%
Trồng cây ở vườn ươm với điều kiện che sáng ~ 50% bằng lưới đen (cường độ sáng ~ 8.000 lux), tưới phun 2 ngày/lần, nhiệt độ 30 - 32oC, độ ẩm 60 - 70%. Theo dõi, ghi nhận, đánh giá cảm quan hình thái cây đến giai đoạn 3 - 12 tháng sau trồng.
2.3.2. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo từ nuôi cấy mô lá
2.3.2.1. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)
Tạo mô sẹo
Vật liệu ni cấy: các mảnh lá có kích thước 10 x 10 mm
Mẫu được cấy vào mơi trường tạo mơ sẹo SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ (0; 1; 2; 3 mg/L), 30 g/L sucrose. Sau cấy 40 ngày, cấy chuyền các mẫu và nuôi tiếp trong 20 ngày nhằm để mơ sẹo hình thành trên tồn bộ bề mặt mảnh lá. Thí nghiệm được thực hiện trên các đĩa petri, cấy 5 mảnh lá/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại. Quan sát, theo dõi sự hình thành mơ sẹo ở 20, 40, 60 NSC.
Cắt các mảnh lá mang mô sẹo (sau đây gọi tắt là mảnh mơ sẹo) ở 60 NSC nói trên thành các mảnh có kích thước (~ 10 x 10 mm/~ 1 cm2), nuôi cấy tiếp trong thời
gian 30 ngày để tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi (KNSP). Tiến hành cấy 5 mảnh mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu ở thời điểm 30 NSC: tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo có KNSP (%), số cụm mơ sẹo có KNSP/mẫu mơ sẹo.
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Xác định mơ sẹo có KNSP dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, cấu trúc, mơ sẹo có KNSP: có dạng cứng, trắng hơi vàng, vàng, cấu trúc chắc, dạng cụm hoặc hạt, phát triển chậm. Mơ sẹo khơng có KNSP có cấu trúc xốp, phát triển nhanh, màu trắng hoặc xám, mềm.
Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường đặc
Vật liệu ni cấy: các cụm mơ sẹo có KNSP
Các cụm mơ sẹo có KNSP thu từ thí nghiệm trên được cắt thành các cụm nhỏ có kích thước ~ 5 mm, cấy vào mơi trường tạo phơi là mơi trường ni cấy có bổ sung loại auxin và nồng độ thích hợp của BA (kế thừa kết quả thí nghiệm tạo phôi trực tiếp). Loại auxin này được bố trí với các nồng độ 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; có 30 g/L sucrose.
Tiến hành cấy 5 cụm mơ sẹo có KNSP/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố . Theo dõi, ghi nhận số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu theo dõi: số cụm mơ sẹo có KNSP tạo phơi, số phơi/cụm mơ sẹo có KNSP, đặc điểm hình thái phơi.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi trường đặc
Sử dụng dao lam cắt ngang phôi tái sinh từ cụm mơ sẹo có KNSP ni trên mơi trường đặc để tạo các lát mỏng tế bào, tiếp theo các mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm màu kép như trên [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường lỏng
Thí nghiệm được tiến hành với nguồn vật liệu là các cụm mơ sẹo có KNSP có đường kính khoảng 5 mm, cấy 30 cụm mơ sẹo có KNSP vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường kế thừa từ kết quả thí nghiệm trên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành phơi ở 10, 14, 30 NSC.
Quan sát, ghi nhận hình thái cụm tế bào sống (khơng nhuộm màu), cụm đa bào sinh phôi (qua nhuộm màu) (ở giai đoạn ~ 10 ngày ni lỏng lắc mơ sẹo có khả năng sinh phơi) dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 50X, 20X, theo thứ tự.
2.3.2.2. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm)
Thí nghiệm này nhằm tạo nguồn vật liệu mơ sẹo cho sự khảo sát tạo phơi sau đó. Vật liệu ni cấy được sử dụng là mảnh lá có kích thước 3 x 10 mm. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Mẫu được cấy trên môi trường tạo mô sẹo là SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L, 30 g/L sucrose. Tiến hành cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mơ sẹo, mơ sẹo có KNSP ở thời điểm 30 NSC.
Tạo phơi
Vật liệu ni cấy: mơ sẹo hình thành từ thí nghiệm 2.3.2.2
Mẫu mơ sẹo được cấy vào môi trường tạo phôi giống môi trường nuôi cấy của thí nghiệm tạo phơi ở mơi trường đặc. Tiến hành cấy 5 mẫu mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hồn tồn ngẫu nhiên. Theo dõi, quan sát sự hình thành phơi; thu thập số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu: số mẫu mô sẹo tạo phôi, số phôi/mẫu mô sẹo. Tiếp tục quan sát, ghi nhận sự phát triển của phôi ở giai đoạn 60 NSC (không thu thập số liệu).
2.3.3. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Phơi vơ tính được xác định là một trong bốn dạng hình thái phát triển của phơi: dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, dạng phơi trưởng thành (dạng phân cực có tiền lá mầm và tiền rễ). Đếm phôi bằng cách quan sát dưới kính lúp và ghi nhận số phơi.
Tiến hành lấy chỉ tiêu theo dõi với 30 mẫu cho mỗi nghiệm thức.
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phơi trực tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 60 sau cấy:
Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) = (Số mẫu tạo phôi/số mẫu cấy) x 100% Số phôi/mẫu = Tổng số phôi/số mẫu tạo phôi
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phơi gián tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 30 sau cấy:
Tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo có KNSP (%) = (𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡ạ𝑜 𝑚ơ 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃