A. Cấy mặt trên mảnh lá tiếp xúc với môi trường (a,c), cấy mặt dưới mảnh lá tiếp xúc
với môi trường (b); B. Mảnh lá nuôi cấy trên mơi trường SH khơng có 2,4-D.
Trước khi bố trí thí nghiệm tạo mô sẹo, tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của 02 cách cấy mảnh lá (trên mơi trường SH có 2 mg/L 2,4-D) đến hiệu quả tạo mơ sẹo đã được thực hiện; một là, cấy mặt trên mảnh lá (có màu xanh đậm, sáng bóng) tiếp
xúc với môi trường; hai là, cấy mặt dưới mảnh lá (màu xanh nhạt, mờ) trên mặt môi trường.
Kết quả cho thấy cách cấy thứ nhất cho kết quả tạo nhiều mơ sẹo hơn ở mép cắt (Hình 3.10Aa,c) so với cách cấy thứ hai (Hình 3.10Ab), có thể do mặt trên lá tiếp xúc với môi trường nên sự hấp thu chất dinh dưỡng ở môi trường tốt hơn, đồng thời mặt dưới lá có nhiều khí khổng, sự trao đổi khí thuận lợi hơn. Khơng ghi nhận sự hình thành mơ sẹo trường hợp ni cấy mảnh lá trên mơi trường khơng bổ sung 2,4- D (Hình 3.10B). Do vậy, cách đặt mẫu mặt trên lá tiếp xúc với môi trường được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.11. Tạo mơ sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm) nuôi cấy trên môi trường SH.
A,B,C. Mảnh lá tạo mô sẹo ở mơi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 20 NSC; D,E,F.
Mảnh lá tạo mơ sẹo (và rễ) ở mơi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 40 NSC; G,H,I. Cụm mô sẹo (sau bỏ rễ, cấy chuyền) trên mơi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 60 NSC (thanh
ngang 10 mm).
Đã ghi nhận nhiều công bố kết quả nghiên cứu như tạo mô sẹo Coffea arabica [120], tạo phôi Coffea arabica và Coffea canephora [121], và kể cả tạo chồi Petunia
hybrida [122] và Sinningia speciosa [123] từ mảnh lá sử dụng thao tác cấy mẫu theo
cách này. Ngược lại, cấy đặt mặt dưới mảnh lá Malus sieversii tiếp xúc với môi trường lại cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh chồi tốt hơn [124]. Như vậy, cách cấy phụ thuộc vào loài thực vật nghiên cứu và ở NGBCC, cấy mặt trên mảnh lá tiếp xúc với mơi
trường đã tạo ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo mơ sẹo và nhìn chung phù hợp với các kết quả công bố chung như đã nêu trên.
Kết quả thí nghiệm tạo mơ sẹo cho thấy, ở 20 ngày sau cấy, mô cấy đã tăng kích thước, mơ sẹo hình thành ở xung quanh mép cắt của tất cả các mẫu cấy mảnh lá trên mơi trường có bổ sung 2,4-D (tỷ lệ 100%); hiệu quả cao nhất ở 3 mg/L 2,4-D, ít nhất ở nghiệm thức có 1 mg/L 2,4-D (Hình 3.11A,B,C). Ngày thứ 40 sau nuôi cấy, nhận thấy các mẫu cấy hình thành khá nhiều rễ ngắn có nhiều lơng hút, đầu rễ trịn, nhiều nhất ở 1 mg/L 2,4-D (Hình 3.11D,E,F). Mẫu cấy sau khi cắt bỏ rễ, cấy chuyền vào môi trường tạo mô sẹo trong 20 ngày tiếp theo, kết quả cho thấy mơ sẹo hình thành trên khắp bề mặt của mảnh lá, hình thành nhiều ở các mẫu cấy trên mơi trường có 2,4-D ở nồng độ 2 và 3 mg/L), mô sẹo phát triển kém ở 1 mg/L 2,4-D. Các mẫu cấy ở 2 mg/L 2,4-D, ghi nhận có sự hình thành một số cụm mô hơi cứng, màu hơi vàng/trắng tương tự mơ sẹo có KNSP, (Hình 3.12H); mơ sẹo xốp hơn ở 3 mg/L 2,4- D (Hình 3.12I). Như vậy, việc cắt bỏ rễ đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành mơ sẹo.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mơ sẹo có KNSP, ở mơi trường
SH, 30NSC. 2,4-D (mg/L) Tỷ lệ (%) mẫu tạo mơ sẹo có KNSP Số cụm mơ sẹo có KNSP/mẫu 1 100 2,20b* 2 100 3,43a 3 100 1,87c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.
Theo tài liệu, đối với cây một và hai lá mầm, 2,4-D có tác dụng rất hiệu quả đến sự hình thành mơ sẹo từ nhiều loại vật liệu nuôi cấy khác nhau như mảnh lá/lá mầm, đoạn thân/trụ mầm/rễ, phôi non,… ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau [125][126]. Tương tự, đối với một số lồi thuộc họ Ngũ gia bì [127], mơ sẹo hình thành có nhiều dạng khác nhau như xốp/cứng và màu sắc khác nhau như trắng đục/trắng trong, hơi vàng/vàng. Ở NGBCC khoảng dao động nồng độ 2,4-D để tạo mô sẹo, nhận được với các dạng mô sẹo và màu sắc khác nhau phù hợp với kết quả nghiên cứu chung ở lĩnh vực này.
Sau 30 ngày cấy các mảnh mơ sẹo để tạo mơ sẹo có KNSP, kết quả cho thấy có sự hình thành các cụm mơ sẹo hơi cứng, màu vàng sáng/hơi đục hình thành trên bề mặt cụm mô sẹo nuôi cấy, đây là các cụm mơ sẹo có KNSP, số lượng cụm mơ sẹo hình thành khác nhau tùy thuộc nồng độ 2,4-D nhiều nhất ở 2 mg/L 2,4-D (3,43), thấp nhất ở 3 mg/L 2,4-D (1,87) (Bảng 3.5, Hình 3.12A,B,C).
Hình 3.12. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mơ sẹo có KNSP, ở môi trường
SH, 30 NSC.
A,B,C. Cụm mơ sẹo có KNSP (vị trí mũi tên) hình thành trên mơi trường có 2,4-D
1; 2; 3 mg/L (thanh ngang 10 mm)
Trong nghiên cứu tạo/duy trì/phát triển sinh khối mơ sẹo có khả năng sinh phơi ở nhiều lồi thực vật thì auxin ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với cytokinin là yếu tố mang tính quyết định, và loại mơ có khả năng tái sinh này có vai trị rất quan trọng đối với nghiên cứu tái sinh cây theo con đường tạo phơi vơ tính (somatic embryogenesis) [68][128][129], kể cả theo con đường tạo chồi. Mơ sẹo có KNSP có thể hình thành ngay ở lần ni cấy đầu tiên hoặc/và ở một số lần cấy chuyền nuôi cấy tiếp theo. Theo Von Arnold và cộng sự (2002), sự khác biệt giữa mơ sẹo có KNSP và mơ sẹo khơng có KNSP dễ ghi nhận, dựa trên hình thái, màu sắc; mơ sẹo có KNSP là thể mơ mang các cụm tế bào có khả năng sinh tiền phơi (proembryogenic masses - PEMs) [68]. Mơ sẹo có KNSP (embryogenic) là thể mơ cứng, trắng hơi vàng, ở dạng cụm/hạt và phát triển chậm – khác với mơ sẹo khơng có KNSP thường có cấu trúc xốp, phát triển nhanh, màu trắng/xám [130]. Theo Gaoyin và cộng sự (2020), ở mơ sẹo có khả năng sinh phơi có sự tích lũy lượng IAA nội sinh, đường hòa tan, tinh bột và protein cao – cơ sở quan trọng về năng lượng cho q trình tạo phơi so với mơ sẹo khơng có khả năng sinh phơi [12]. Như đã trình bày, ở NGBCC, sự phát sinh mơ sẹo có KNSP được ghi nhận sau giai đoạn cấy chuyền mơ sẹo có thể do ở lần nuôi cấy đầu tiên sự hiện diện của rễ tái sinh đã gây hạn chế sự hình thành loại mơ này. Từ các
kết quả trên đây, mảnh lá được ni cấy trên mơi trường có 2 mg/L 2,4-D để thu mơ sẹo có KNSP phục vụ nghiên cứu tái sinh phôi ở giai đoạn tiếp theo.
Tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x10 mm) trên mơi trường đặc
Từ kết quả thí nghiệm trên thu được các cụm mơ sẹo có KNSP (Hình 3.13A) sử dụng làm vật liệu tạo phôi, được ni cấy trên mơi trường SH có 0,25 mg/L BA kết hợp với NAA (1, 2, 3, 4, 5 mg/L). Quan sát mẫu sau 30 ngày cấy, kết quả cho thấy ở tất cả các cụm mơ sẹo có KNSP trên môi trường nuôi cấy SH đều có hiện tượng tái sinh phơi (tỷ lệ 100%), số phơi hình thành nhiều nhất ở mơi trường có 2 – 3mg/L NAA tương ứng số phơi tái sinh/cụm là 15,5; 15,8 ít nhất ở mơi trường có NAA 1 mg/L với số phơi/cụm mơ sẹo là 7,2. Ở nghiệm thức có 2, 3 mg/L NAA khơng có sự khác biệt về thống kê cả hai chỉ tiêu theo dõi, nhưng khác biệt so với các nghiệm thức cịn lại (Bảng 3.6, Hình 3.13).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x 10
mm), ở môi trường SH, 30 NSC. NAA (mg/L) BA (mg/L) Số cụm mơ sẹo có KNSP dùng ni cấy Số phơi tái sinh/cụm
Đánh giá định tính về phơi tái sinh
1 0,25 30 7,20d* Phôi dài, rễ phôi ngắn
2 0,25 30 15,50a Phôi dài, rễ phôi ngắn
3 0,25 30 15,80a Phơi ngắn, rễ phơi ngắn có lơng hút 4 0,25 30 10,80b Phôi ngắn; một số phơi có rễ dài,
nhiều lông hút
5 0,25 30 9,50c Phơi rất ngắn, nhiều rễ có lơng hút trên cụm phơi; cụm có nhiều mô sẹo
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức
p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.
Tương tự trường hợp tạo mơ sẹo có KNSP, cũng sử dụng auxin (2,4-D/NAA) kết hợp với cytokinin (BA/kinetin) trong tạo phơi vì cytokinin thường giúp kích thích phơi hình thành và phát triển; trong một số trường hợp, sự tạo phôi và sự trưởng thành của phôi được ghi nhận trong điều kiện sử dụng cùng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng [131]. Tuy nhiên, ở đa số trường hợp tạo phơi, mơ sẹo có khả năng sinh phơi
cần được ni cấy trên mơi trường có nồng độ auxin giảm hoặc khơng bổ sung auxin [132]. Theo hướng này, auxin NAA (có hoạt tính sinh lý thấp hơn 2,4-D) thường được sử dụng nhằm kích thích tái sinh phơi và kích thích phát triển phơi tiếp tục sau khi đã hình thành và ở nghiên cứu này, auxin NAA được lựa chọn sử dụng phục vụ nghiên cứu tái sinh phôi. Tương tự như ở nghiên cứu của Gaoyin và cộng sự (2020) [12]. Theo Yu và cộng sự (2017) [99], tuy ở điều kiện ni cấy có nồng độ auxin cao nhưng ở khối mơ sẹo ln có sự phân bố khơng đồng đều của auxin theo không gian (spatial) do sự di chuyển phân cực của auxin có khác nhau ở các vị trí khác nhau, do vậy có thể xảy ra hiện tượng biệt hóa từng phần/tồn phần khi ở điều kiện thuận lợi (ví dụ chuyển sang ni cấy sử dụng nồng độ auxin thấp, hoặc dùng loại auxin nuôi cấy phù hợp) – các cấu trúc như phơi/rễ bất định có thể được tái sinh.
Hình 3.13. Tái sinh phơi từ mơ sẹo có khả năng sinh phơi trên mơi trường đặc SH,
30 NSC và hình thái giải phẫu phơi tái sinh từ mô sẹo.
A. Vật liệu mơ sẹo có KNSP (vị trí mũi tên); B,C,D,E,F. Phơi tái sinh trên mơi trường
có NAA 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; G,H. Phơi bước đầu hình thành (vị trí mũi tên) từ cụm
mơ sẹo có KNSP và hình thái giải phẫu phơi tương ứng (vạch chéo đen chỉ vị trí cắt
Đến nay đã ghi nhận nhiều nghiên cứu tạo phôi hiệu quả khi kết hợp 2,4-D và BA/kinetin, như trường hợp tạo phôi Passiflora mollissima từ mơ sẹo lá mầm trên
mơi trường MS có 4,5 μM 2,4-D và 4,5 μM BA [133]. Với Psoralea corylifolia, sự kết hợp NAA và BA rất quan trọng đối với tạo mơ sẹo có KNSP (từ vật liệu trụ dưới lá mầm) với NAA (2,7 - 10,8 µM), BA 2,2 µM và tái sinh phơi từ mơ sẹo với NAA 1,4 µM, BA 2,2 µM [134]. Sự kết hợp của NAA (0,5 - 5 mg/L) với BA 0,5 mg/L ln cần thiết đối với tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mảnh lá/lá mầm Solanum nigrum [135]. Tương tự, tổ hợp NAA và BA cũng rất thích hợp để tạo phơi từ mô sẹo lá Citrullus
colocynthis [136], mô sẹo phôi hạt non Tapiscia sinensis [94], mô sẹo phôi hợp tử
non Picea abies và P. omorika [137]. Kết quả thí nghiệm cho thấy, lần nữa NAA đã chứng tỏ rất thích hợp cho tái sinh phơi gián tiếp từ mô sẹo với nồng độ 2 mg/L và cytokinin BA cũng rất cần thiết cho quá trình tái sinh phôi với nồng độ sử dụng là 0,25 mg/L – tương tự như ở nghiên cứu tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phơi
Khảo sát hình thái giải phẫu phơi tái sinh từ cụm mơ sẹo có khả năng sinh phơi (Hình 3.13G) bằng phương pháp nhuộm hai màu và quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi đã được thực hiện. Kết quả cho thấy phơi cầu hình thành trên bề mặt khối mơ sẹo với lớp biểu mô đặc trưng (Hình 3.13H). Qua khảo sát tế bào học, Sakr và Sayed (2018) kết luận phơi Oryza sativa có nguồn gốc từ một số tế bào phơi ở phần ngồi của các cụm mô sẹo phôi hợp tử đang phát triển sinh khối trên mơi trường MS có (2 - 2,5 mg/L) 2,4-D [138]. Ở trường hợp tạo phôi Carica papaya từ mô sẹo lá mầm phôi hạt, phôi tái sinh bắt nguồn từ các cấu trúc dạng cầu có có khả năng sinh tiền phơi (pre-embryogenic globular structures) hình thành từ các tế bào vùng bề mặt và dưới bề mặt của cụm mô sẹo [139]. Tương tự, các tiền phơi Tapiscia sinensis hình thành từ lớp tế bào bề mặt (surface layer) và dưới bề mặt hoặc bên trong (internally) của cụm mơ sẹo có KNSP [94]. Như vậy, theo chúng tôi, phôi NGBCC tạo từ mơ sẹo có KNSP cũng bắt nguồn từ hoạt động phân chia của loại mô tế bào đặc trưng tương tự như ở kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên và cơ sở sinh lý của q trình tạo phơi là do sự di chuyển phân cực của auxin, làm thay đổi lập trình di truyền của tế bào mơ sẹo dẫn đến sự hình thành tế bào mang tính tồn thế - có khả năng tái sinh cơ quan [15].
Hình 3.14. Các dạng phát triển của phơi tái sinh từ mơ sẹo mảnh lá, cây con hồn
chỉnh từ phôi.
A. Phôi cầu đơn; B. Phôi dạng tim; C. Giai đoạn đầu của phôi dạng thủy lôi; D,E.
Phôi thủy lôi đơn và cụm 2 phôi thủy lơi phát triển; F,G,H. Phơi có lá mầm và rễ
mầm phát triển đến giai đoạn trưởng thành; I. Cây con hồn chỉnh từ phơi với lá mầm, lá thật (đơn và kép), rễ cọc điển hình và nhiều rễ phụ
Tương tự như ở q trình nghiên cứu tạo phơi trực tiếp từ mảnh lá, trong quá trình tái sinh phơi từ mơ sẹo, cũng đã ghi nhận được đầy đủ các dạng phát triển khác nhau của phôi như phơi dạng cầu (Hình 3.14A), dạng tim (Hình 3.14B), dạng thuỷ lơi (Hình 3.14C,D,E), dạng bước đầu có lá mầm, rễ mầm (Hình 3.14F,G) và dạng phơi trưởng thành (Hình 3.14H). Phơi trưởng thành phát triển bình thường thành cây con qua ni cấy tiếp tục trên mơi trường ½MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng (Hình 3.14I).
Tạo phơi từ mơ sẹo mảnh lá (10 x10 mm) trong môi trường lỏng
Từ vật liệu là các cụm mơ sẹo có KNSP (Hình 3.15A), ni cấy tái sinh phơi trong mơi trường lỏng lắc cũng đã được thực hiện dùng mơi trường SH có 2 mg/L NAA và 0,25 mg/L BA (kế thừa từ thí nghiệm trên). Kết quả cho thấy, phơi hình thành dần theo thời gian ở 7, 10, 14 và 30 NSC (Hình 3.15B,C,D,E,F,G).
Hình 3.15. Tạo phơi từ mơ sẹo có KNSP bằng phương pháp ni lỏng lắc, hình thái
cụm tế bào phân chia, cụm mơ tạo phơi.
A. Các cụm mơ sẹo có KNSP làm vật liệu tạo phơi (vị trí mũi tên); B,C,D. Bình ni
các cụm mơ sẹo có KNSP giai đoạn mới cấy, 7 NSC, 30 NSC; E,F,G. Cận cảnh tạo phơi từ cụm mơ sẹo có KNSP ở 10, 14, 30 NSC; H. Hình thái cụm tế bào phân chia theo hướng tạo phơi (vịng trịn (a) chỉ vị trí tế bào phân chia khơng cân xứng và vịng trịn (b) chỉ vị trí cụm tế bào nhỏ đẳng kính); I. Phơi dạng cầu hình thành ở giai đoạn đầu ở cụm mơ có KNSP (vị trí mũi tên); J. Phơi dạng cầu phát triển (các hình H,I,J được chụp dưới kính hiển vi với độ phóng đại 50X, 20X, 20X, theo thứ tự)
Quan sát hình thái cụm tế bào/cụm mơ (có nguồn gốc mơ sẹo có khả năng sinh phơi) ni lỏng lắc
Trong q trình theo dõi, quan sát mô sẹo nuôi lỏng lắc, ghi nhận được hai hiện tượng xảy ra có thể liên quan đến sự tạo phôi, một là, sự phân chia tế bào không đối xứng (asymmetric division/ unequal division pattern) dẫn đến sự hình thành hai tế bào khơng cùng kích cỡ (Hình 3.15Ha) – tương tự như ở trường hợp hình thành phơi hợp tử và nhiều trường hợp hình thành phơi vơ tính [68]; hai là, sự hình thành cụm tế bào trịn nhỏ, đẳng kính (isometric), có vách dày (Hình 3.15Hb). Grzebelus và cộng sự (2012) đã ghi nhận được hiện tượng phân chia tế bào không đối xứng ở
ni cấy tế bào trần có nguồn gốc từ mơ lá, trụ dưới lá mầm Daucus carota dẫn đến sự hình thành cụm đa bào (multi-cell colonies) có kết cấu chặt (tightly packed), tế bào dạng tròn, tế bào chất đậm đặc ở 5 – 10 NSC, với kích cỡ nhỏ hơn tế bào ban đầu; sau đó các cụm này phát triển thành cụm tiền phôi (proembryonic mass), tạo phôi cầu ở 21 – 28 NSC và phơi có lá mầm ở 30 – 60 NSC [140]. Iantcheva và cộng sự (2004) đã nghiên cứu chi tiết sự phân chia không đối xứng của quần thể tế bào đơn (100 - 200 µm) Medicago falcata đối chứng và chuyển gen (gusA) và kết luận hầu hết các tế bào có sự phân chia khơng đối xứng (~ 80%, 50 – 75% tế bào phân chia