3.1. Tạo phơi vơ tính
Trong nghiên cứu này, phơi vơ tính hình thành trực tiếp được định nghĩa là phôi tái sinh ngay ở lần nuôi cấy đầu tiên, khác với phôi tái sinh gián tiếp qua hai giai đoạn nuôi cấy là giai đoạn tạo mô sẹo và phát sinh phôi từ mô sẹo [108][109].
3.1.1. Tạo phôi vơ tính trực tiếp từ mơ lá
3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khống đến sự tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá vơ tính trực tiếp từ mơ lá
Hình 3.1. Các dạng phát triển của phơi vơ tính hình thành trực tiếp từ mơ lá.
A,B. Phôi cầu đơn, cụm phôi cầu; C. Phôi dạng tim (1) và dạng cầu (2); D. Phơi dạng
thủy lơi; E,F,G,H. Phơi có lá mầm và rễ mầm phát triển; I. Cây con hoàn chỉnh lá
mầm, lá thật (đơn, kép), rễ cọc điển hình. Mũi tên chỉ lá mầm (trắng), rễ mầm (đen). Thanh ngang 2 mm.
Sau 5 tuần ni cấy, phơi vơ tính xuất hiện ở nhiều nghiệm thức, ở mơi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA phơi xuất hiện sớm và nhiều nhất, mơi trường ½MS phơi phát sinh chậm, ít hơn. Sự phân hóa cấu trúc trong q trình phát sinh phơi từ mảnh lá NGBCC bắt đầu từ dạng phôi cầu, xuất hiện khoảng 32 – 35 NSC, có màu vàng nhạt (Hình 3.1A), giai đoạn phơi hình tim có màu xanh, xuất hiện sau đó khoảng 10 ngày, đây là dấu hiệu tiền hai lá mầm, dạng đặc trưng của sự hình thành phơi ở cây hai lá mầm (Hình 3.1C). Dạng phơi thủy lơi (Hình 3.1D) phát triển tiếp đến giai đoạn có hai lá mầm khoảng 15 – 20 ngày tiếp theo (Hình 3.1E,F,G,H). Phơi phát sinh trực
tiếp từ mảnh lá NGBCC đã trải qua tuần tự 04 dạng phát triển của phôi.
Quan sát sự phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC nhận thấy, các hình dạng khác nhau và các giai đoạn phát triển của phôi cùng xuất hiện trên cùng mẫu cấy (Hình 3.1C1,C2), điều đó chứng tỏ q trình phát sinh phơi khơng đồng bộ và các tế bào khi đủ điều kiện sẽ phát sinh phôi.
Sau 60 ngày nuôi cấy, ở môi trường không bổ sung NAA/IBA, các mẫu cấy đều khơng phát sinh hình thái, khơng xuất hiện phơi, mẫu cấy hóa nâu và chết sau đó, điều đó chứng tỏ lượng chất ĐHST nội sinh ít khơng đủ cảm ứng phát sinh phơi. Tất cả các mẫu cấy trên mơi trường ½MS, MS, B5, SH có bổ sung IBA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L), đều không ghi nhận được cấu trúc phôi xuất hiện trong suốt 60 ngày nuôi cấy (khơng trình bày số liệu). Ngược lại, các nghiệm thức bổ sung NAA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L) vào mơi trường ni cấy đều có cảm ứng tạo phơi vơ tính theo hướng tích cực (Hình 3.2). Điều đó chứng tỏ, sự cảm ứng tạo phơi của mảnh lá NGBCC đối với mỗi loại auxin trong môi trường ni cấy là khác nhau và cần có loại auxin ngoại sinh thích hợp là NAA, cịn IBA hồn tồn khơng thích hợp cho sự cảm ứng tạo phơi.
Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu tăng khi tăng nồng độ NAA (1 – 5 mg/L) trong môi trường nuôi cấy, khi tăng nồng độ 6 mg/L NAA thì tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm. Khi xét các mức nồng độ NAA và các loại mơi trường khống, nhận thấy mơi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L NAA có tỷ lệ mẫu tạo phơi (%) và số phôi/mẫu thấp nhất (24,44% và 6,18 phôi/mẫu). Các chỉ tiêu này đạt giá trị cao nhất khi mơi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA với tỷ lệ mẫu tạo phơi 88,89% và 19,95 phơi/mẫu (Hình 3.2L). Kết quả này có ý nghĩa khác biệt về thống kê so với tất cả các nghiệm thức cịn lại. Điều đó chứng tỏ, tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) và số phôi/mẫu chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ của loại auxin thích hợp (NAA) và loại mơi trường khống phù hợp. Như vậy, nồng độ 5 mg/L NAA là tối ưu để kích thích tạo phơi đạt hiệu quả cao nhất từ mảnh lá NGBCC, trong môi trường ni cấy có hàm lượng và thành phần khống thích hợp là SH.
Sự cảm ứng phát sinh phôi từ mơ lá NGBCC chỉ ở những nghiệm thức có bổ sung NAA, số phơi phát sinh ít hoặc nhiều tùy thuộc nồng độ NAA sử dụng, điều này cho thấy vai trị của auxin ngoại sinh là mang tính quyết định. Qua vết thương của mẫu cấy làm tăng sự hấp thụ auxin ngoại sinh, sự hiện diện của auxin ngoại sinh (NAA) trong tế bào làm tăng IAA nội sinh thơng qua q trình tổng hợp IAA nội
sinh, sự gia tăng của IAA nội sinh khơng thể thiếu để thay đổi chương trình di truyền dẫn đến phát sinh phôi, sự cân bằng nội môi của các auxin rất quan trọng cho cảm ứng tạo phôi [90]. Sự khác nhau về loại và nồng độ auxin ngoại sinh áp dụng trong mối tương tác với sinh tổng hợp auxin nội sinh có vai trị quan trọng trong phát sinh phơi vơ tính [88][89]. Vai trị của auxin ngoại sinh và sự vận chuyển phân cực của auxin, đóng vai trị quan trọng trong sự phát sinh phơi vơ tính, điều này được Verma và cộng sự (2018) chứng minh trong nghiên cứu tác động của auxin ngoại sinh đến phát sinh phơi vơ tính trực tiếp của Digitalis trojana [14].
Như vậy, auxin trong đó có NAA là yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh phơi, có vai trị quan trọng kênh thơng tin tế bào - làm tế bào biến đổi đến trạng thái cuối cùng đã được chương trình hóa là phát sinh phơi vơ tính [65]. Tuy nhiên khả năng đáp ứng tạo phôi của mô thực vật khác nhau đối với các loại auxin trong môi trường là khác nhau [70].
Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy
in vitro, chứa thành phần và hàm lượng các chất khống cần thiết cho sự phát sinh
phơi. Trong thí nghiệm này, sử dụng các mơi trường khoáng thường sử dụng trong nghiên cứu phát sinh phơi vơ tính ở họ Ngũ gia bì là MS, B5, SH [72][71][38] và ½MS. Kết quả sau 60 ngày ni cấy, phôi phát sinh cao nhất ở môi trường SH và thấp nhất ở mơi trường ½MS, điều đó chứng tỏ thành phần và hàm lượng chất khống có tác động đến sự phát sinh phơi và mơi trường khống SH thích hợp nhất cho cảm ứng tạo phơi trực tiếp từ mô lá NGBCC.
Như vậy, hiệu quả phát sinh phơi chịu ảnh hưởng bởi loại, nồng độ auxin thích hợp, hàm lượng và thành phần khống của mơi trường ni cấy, trong đó auxin có vai trị quyết định. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ % mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu nhiều nhất ở mơi trường ni cấy SH có 5 mg/L NAA. Đây là nghiên cứu đầu tiên thực hiện thành cơng tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC.
Thí nghiệm này, 2,4-D cũng đã được bố trí thực hiện trên NGBCC nhưng với kết quả âm tính trong tạo phơi, chỉ ghi nhận được hiện tượng hình thành mơ sẹo.
Theo một số tác giả, kiểu gen thực vật [109], loại mơi trường khống cơ bản [110], một số thành phần khống đơn lẻ [111], cơng thức mơi trường ni cấy bao gồm chất ĐHST,..[112][70] có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành phơi vơ tính trực tiếp/gián tiếp.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NAA và mơi trường khống đến sự tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá ở 60 NSC. NAA (mg/L) Mơi trường khống Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) Số phôi/mẫu 0 ½MS 0.00q* 0,00r 1 ½MS 24,44p 6,18v 2 ½MS 33,33o 6,29u 3 ½MS 42,22n 7,02s 4 ½MS 52,22l 7,74n 5 ½MS 56,67k 8,71k 6 ½MS 46,67m 7,16p 0 MS 0.00q 0,00r 1 MS 57,78k 6,58t 2 MS 61,11j 7,29p 3 MS 66,67gh 8,67k 4 MS 75,56c 10,00h 5 MS 78,89b 11,69e 6 MS 68,89f 9,07j 0 B5 0.00q 0,00r 1 B5 47,78m 7,11st 2 B5 51,11l 7,47p 3 B5 56,67k 8,36l 4 B5 65,56hi 9,19i 5 B5 73,33d 12,48d 6 B5 64,44i 10,23g 0 SH 0.00q 0,00r 1 SH 60.00j 7,89m 2 SH 67,78fg 9,11ij 3 SH 71,11e 11,27f 4 SH 78,89b 15,24b 5 SH 88,89a 19,95a 6 SH 74,44cd 13,57c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥
Hình 3.2. Mảnh lá tạo phơi ở mơi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA, 60 NSC.
A,B,C,D. Mơi trường ½MS, MS, B5, SH có 3 mg/L NAA; E,F,G,H. Mơi trường
½MS, MS, B5, SH có 4 mg/L NAA; I,J,K,L. Mơi trường ½MS, MS, B5, SH có 5 mg/L NAA; thanh ngang 10 mm.
Khác với cảm ứng tạo phơi trực tiếp, q trình tạo phơi gián tiếp có thể gây ra biến dị dịng soma ở chuỗi DNA do trải qua giai đoạn mô sẹo [113]. Do vậy, theo chúng tôi tạo phôi trực tiếp rất có ý nghĩa trong nhân giống cây trồng – nghiên cứu dựa trên nguyên tắc đồng nhất về mặt di truyền.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
Khảo sát cấu trúc giải phẫu phôi bằng phương pháp nhuộm hai màu đối với 03 thể phôi (cầu, trái tim, thủy lơi) đã được thực hiện. Quan sát dưới kính hiển vi, đã ghi nhận được lớp tế bào biểu bì (epidermis) đặc trưng ở cả 03 dạng phôi, và sự hiện diện của mạch dẫn ở cấu trúc phơi dạng thủy lơi (Hình 3.3).
Hình 3.3. Các giai đoạn phát triển của phơi vơ tính và hình thái giải phẫu phơi
tương ứng.
A,B,C. Dạng phơi cầu, phơi tim, phơi thủy lơi; D,E,F. Hình thái giải phẫu tương ứng
dạng phôi cầu, phôi tim, phơi thủy lơi, (LM: Lá mầm, BB: Biểu bì, M: Mạch; thanh ngang 1 mm).
3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mô lá mô lá
Phân tích số liệu (Bảng 3.2) cho thấy, mơi trường ni cấy có NAA được bổ sung BA với các mức nồng độ (0,25; 0,5; 1 mg/L) thì kết quả tạo phơi có khác biệt về thống kê giữa các nghiệm thức. Điều đó chứng tỏ, sự kết hợp của NAA và BA có ảnh hưởng đến sự phát sinh phơi. Nhận thấy, khi sử dụng BA (0,25; 0,5; mg/L) kết hợp với NAA (3, 4, 5 mg/L) mơ lá có biểu hiện đáp ứng tích cực, các chỉ tiêu theo dõi đều cao hơn khi môi trường nuôi cấy bổ sung auxin (NAA) riêng lẻ, không kết hợp với BA, cụ thể tỷ lệ mẫu cấy tạo phôi và số phơi/mẫu tăng, cao nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA kết hợp với 0,25 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi là 94,44% và 28,56 phôi/mẫu), cao hơn nghiệm thức đối chứng 5 mg/L NAA (tỷ lệ mẫu tạo phơi 88,89% và 19,95 phơi/mẫu). Nhưng các nghiệm thức có NAA (3, 4, 5 mg/L) khi bổ sung 1 mg/L BA, thì mẫu cấy tạo phơi chậm, tỷ lệ tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm, thấp nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA và 1 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 57,78% và 9,67 phôi/mẫu). Như vậy, khi bổ sung BA với nồng độ tối ưu đã phát huy vai trị của NAA trong q trình phân bào và phát sinh phơi vơ tính trực tiếp với hiệu quả
cao nhất. Từ kết quả trên cho thấy, sự hiện diện của auxin (NAA) kết hợp với cytokinin (BA) là cần thiết cho q trình phát sinh phơi NGBCC, sự tương tác này có tác động tích cực và hiệu quả khi nồng độ của chất ĐHST thích hợp (Hình 3.4D,E).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phơi vơ tính trực tiếp từ
mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC. NAA (mg/L) BA (mg/L) Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) Số phôi/mẫu 3 0 71,11g* 11,27h 4 0 78,89e 15,24e 5 0 88,89c 19,95b 3 0,25 75,56f 15,78e 4 0,25 82,22d 18,83c 5 0,25 94,44a 28,56a 3 0,5 72,22g 12,67g 4 0,5 80,00e 18,00d 5 0,5 91,11b 20,67b 3 1 67,78h 10,67i 4 1 65,56i 14,33f 5 1 57,78j 9,67j
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥
khi phân tích thống kê.
Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phơi)
đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phơi vơ tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào, và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mơ ni cấy, do vậy cũng có vai trị quan trọng trong tạo phôi [82]. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phơi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phơi như đã nêu trên.
Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở mơi trường SH có NAA và BA, 60 NSC.
A,B,C. Mơi trường SH có 4 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L; D,E,F. Mơi trường
SH có 5 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L. Thanh ngang 5 mm.
Kết quả tác động tích cực của BA đối với sự hình thành phôi NGBCC ở nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a) khi bổ sung thêm kinetin/BA (0,25 – 5 mg/L) vào môi trường dùng tạo phôi Panax pseudoginseng [71]. Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái
sinh phơi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phơi vơ tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mơ ni cấy và do vậy cũng có vai trị quan trọng trong tạo phơi [82]. Từ nuôi cấy mảnh lá mầm phôi hợp tử Cucumis sativa trên mơi trường có BA ở điều kiện chiếu sáng, Li và cộng sự (2007) nhận thấy BA, ngoài tác động làm tăng kích thước mảnh lá mầm cũng đã làm tăng hàm lượng cytokinin nội sinh [5]. Qua nghiên cứu mối liên quan giữa hàm lượng chất ĐHST nội sinh với các giai đoạn phát triển khác nhau của phơi vơ tính từ ni cấy mơ phơi hợp tử Ormosia
henryi, Gaoyin và cộng sự (2020) [12] nhận thấy hàm lượng auxin đạt cao ở giai đoạn phát triển và sự phân cực của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs cao), và hàm
lượng cytokinin cũng cao ở giai đoạn trưởng thành và nẩy mầm của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs giảm).
Như vậy, chất ĐHST ngoại sinh có vai trị khơng thể thay thế trong cảm ứng tạo phơi vơ tính và nồng độ của chúng ảnh hưởng đến sự cân bằng chất ĐHST nội sinh trong đó có cytokinin, giúp điều hịa sự tăng trưởng và phát sinh hình thái. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phơi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phôi như đã nêu trên.
3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vơ tính trực tiếp từ mơ lá tính trực tiếp từ mơ lá
Kết quả sau 60 ngày ni cấy (Bảng 3.3, Hình 3.5) cho thấy, nồng độ sucrose 50 g/L ở trường hợp chiếu sáng đã có ảnh hưởng tích cực nhất đến sự phát sinh phơi vơ tính (Hình 3.5C) so với các trường hợp nồng độ sucrose còn lại và so với trường hợp để mẫu trong tối, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu lần lượt là 98,89% và 35,95 phôi/mẫu. Khi nồng độ sucrose cao đã làm tăng khả năng giữ nước của môi trường, tế bào nhận nước từ môi trường kém thuận lợi - mơ khơ hơn do vậy kích thích sinh lý tế bào biến đổi mạnh, tạo thuận lợi cho quá trình phát sinh phơi. Khi nồng độ sucrose ở môi trường nuôi cấy tăng cao 70 g/L làm tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu giảm (tương ứng là 87,78% và 18,72 phôi/mẫu), do áp suất thẩm thấu tăng cao nên tế bào bị ‘sốc’ thiếu nước, sinh lý tế bào bị ức chế, trao đổi chất giảm. Khi nồng độ sucrose giảm cịn 10 g/L thì q trình tạo phơi giảm rõ rệt, phát sinh hình thái chậm dù vẫn ở điều kiện sáng. Nghiệm thức có 50 g/L sucrose ở điều kiện tối khơng khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức 10 g/L sucrose ở điều kiện sáng khi xét về tỷ lệ % mẫu tạo phơi, nhưng số phơi/mẫu có khác biệt rõ. Như vậy, với các mức nồng độ sucrose khác nhau trong điều kiện chiếu sáng khác nhau đã có ảnh hưởng khác