CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Sự phát sinh phơi vơ tính
1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phơi vơ tính
Phơi vơ tính/phơi soma/phơi sinh dưỡng (somatic embryogenis) đều là khái niệm mô tả một cấu trúc lưỡng cực gồm cực chồi và cực rễ, bắt nguồn từ tế bào sinh dưỡng hay tế bào soma, dưới những điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một cơ thể có chức năng hồn chỉnh. Q trình hình thành phơi vơ tính trải qua các giai đoạn tương tự như phát sinh phôi hợp tử, trải qua các giai đoạn phơi hình cầu, hình trái tim, dạng thủy lơi và giai đoạn lá mầm, và sau đó phát triển thành cây con hồn chỉnh. Trong q trình phát triển phơi vơ tính, các giai đoạn hình thái khơng có kết nối với mơ mạch [65]. Phơi vơ tính rất giống phơi hữu tính về mặt hình thái, q trình phát triển cũng như về mặt sinh lý nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, khơng có q trình tái tổ hợp di truyền, các phơi vơ tính mang thơng tin di truyền giống hệt tế bào soma đã sinh ra nó. Phơi vơ tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào. Thơng qua một q trình phân chia có thứ tự phơi diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con [66].
Q trình phát sinh phơi vơ tính đại diện cho mơ hình tồn thế hồn chỉnh, liên quan đến hoạt động của các tín hiệu phức tạp, cũng như việc lập trình lại sự biểu hiện gen được điều chỉnh cụ thể. Sự điều hịa này đáp ứng với các kích thích ngoại sinh được tạo ra do các chất ĐHST thực vật [65]. Cảm ứng phát sinh phơi vơ tính có tính năng kích hoạt lại chu kỳ tế bào trong các tế bào thực vật đã được biệt hóa, dưới tác động của các kích thích bên ngồi. Từ đó, mở ra con đường chuyển từ loại tế bào soma sang loại tế bào sinh phơi [67]. Các kích thích này khởi động chương trình di truyền dẫn đến thiết lập các dịng tế bào có kiểu gen phiên mã bị thay đổi, đầu tiên là sự hình thành cấu trúc khơng đối xứng đỉnh – đáy. Phơi vơ tính trưởng thành giống
phôi hợp tử đều thể hiện đỉnh – đáy và phân cực hướng tâm, có chồi sơ cấp và mơ phân sinh rễ, chứa các cơ quan phơi điển hình, lá mầm, rễ mầm [66] .
Tế bào thực vật có tính tồn thế do vậy có thể tái tạo thành cây hồn chỉnh thơng qua con đường phát sinh phơi vơ tính (nhờ vai trị quan trọng của auxin và cytokinin, ABA, các stress,..) hoặc/và con đường phát sinh cơ quan. Theo Von Arnold và cộng sự (2002), sự phát sinh phơi vơ tính được xác định là q trình hình thành cấu trúc có hai cực chồi và rễ tương tự như phơi hợp tử, mỗi cực đều có mơ phân sinh và hệ thống tiền mạch (provascular) phân biệt với hệ mạch ở thể chồi/cụm chồi tái sinh theo con đường phát sinh cơ quan. Phơi vơ tính hình thành và phát triển từ tế bào sinh dưỡng, có thể tái sinh trực tiếp từ mô nuôi cấy mà không qua giai đoạn trung gian là mô sẹo hoặc/và tái sinh từ mô sẹo (tái sinh gián tiếp) [68]. Theo tài liệu, ở tạo phơi vơ tính trực tiếp, phơi có nguồn gốc từ tế bào PEDC (Pre-Embryogenic Determined Cell) – tế bào được xác định có khả năng tạo phơi; ở tạo phơi gián tiếp, phơi hình thành từ tế bào IECD (Induced Embryogenic Determined Cell) – tế bào được xác định có khả năng tạo phơi thơng qua cảm ứng.
Ở tạo phôi trực tiếp, theo một số tài liệu, ghi nhận có các bước tạo phơi vơ tính cơ bản như: (1) Khởi tạo loại tế bào có khả năng sinh phơi từ một số loại tế bào khác nhau ở mô cấy ban đầu như tế bào biểu bì/dưới biểu bì hoặc tế bào ở/gần vùng hệ mạch dưới tác động của auxin (có hoặc khơng có cytokinin) ngoại sinh, tác nhân tạo áp suất thẩm thấu cao,..; (2) Khởi tạo phôi với các giai đoạn phát triển khác nhau, và (3) Phôi phát triển với hệ mạch độc lập với mô mẹ.
Ở tạo phôi gián tiếp, theo Von Arnold và cộng sự (2002), có 5 bước từ lúc tạo vật liệu tế bào có khả năng sinh phơi đến giai đoạn nhận được cây hồn chỉnh, là (1) Tạo được vật liệu tế bào có khả năng sinh phơi từ nuôi cấy vật liệu ban đầu (như mảnh lá,..) trên mơi trường có auxin (có hoặc khơng có cytokinin); (2) Ni cấy nhân sinh khối tế bào có khả năng sinh phơi trên mơi trường đặc hoặc trong môi trường lỏng với chất ĐHST như trên; (3) Nuôi cấy ‘tiền trưởng thành’ phôi ở môi trường khơng có chất ĐHST, điều này ức chế sự tiếp tục tăng sinh khối và kích thích sự hình thành và phát triển phôi ở giai đoạn ban đầu; (4) Tạo phôi trưởng thành qua nuôi cấy trên mơi trường có ABA hoặc/và có áp suất thẩm thấu giảm; (5) Tạo cây con qua nuôi cấy trên mơi trường khơng có chất ĐHST [68].
Đến nay, q trình và cơ chế sinh phơi ở thực vật mơ hình Arabidopsis đã được chỉ rõ. Ở tạo phôi trực tiếp, tế bào xác định đi vào con đường tạo phôi chỉ một thời gian ngắn sau bước tái lập trình di truyền, không cần trải qua phân bào trước; ngược lại, ở tạo phôi gián tiếp, khả năng sinh phôi (embryogenic competence) vẫn giữ ở mức tương đối sau giai đoạn tạo mô sẹo [69].
Phương pháp tạo phơi vơ tính trực tiếp có nhiều ưu điểm so với tạo phơi vơ tính gián tiếp:
Do không thông qua giai đoạn ni cấy tạo mơ sẹo, hơn nữa phơi hình thành trên bề mặt mơ cấy do vậy hiện tượng tái lập trình (reprogramming) về mặt di truyền ở mức tối thiểu, lại hình thành trong thời gian tương đối ngắn [68], nên phôi tái sinh ít bị biến dị, do vậy có tiềm năng ứng dụng cao thể phôi này đặc biệt trong trong nghiên cứu nhân giống, bảo quản lạnh phôi và biến nạp gen,... Tạo phôi trực tiếp đơn giản hơn trong kỹ thuật ni cấy; ngược lại q trình tái sinh phơi gián tiếp trải qua các bước cảm ứng và tăng sinh mơ sẹo tạo phơi, phải lập trình lại nên địi hỏi dài về mặt thời gian, vì vậy, cơ chế điều hòa và cảm ứng phức tạp hơn so với sự hình thành phơi vơ tính trực tiếp. Mức độ phụ thuộc vào chất ĐHST khác nhau giữa tạo phôi trực tiếp và gián tiếp [70].
Có thể nhân sinh khối phơi thơng qua cơ chế tạo phôi thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc và phương pháp dùng bioreactor dùng cho nhiều mục đích khác nhau đặc biệt cho nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp.
1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phơi vơ tính
Nói chung, sự phát sinh phơi vơ tính (ở các giai đoạn nêu trên) đều chịu ảnh hưởng bởi một số yếu tố như kiểu gen thực vật, tuổi sinh lý và loại mẫu nuôi cấy, thành phần mơi trường khống, chất ĐHST, đường, cường độ ánh sáng,.. Ở
Arabidopsis, khá nhiều loại, kích thước mẫu với tuổi sinh lý khác nhau đã được sử
dụng để tạo phơi vơ tính như phơi hợp tử trưởng thành và phôi non, chồi, nụ hoa. Ở
Sapindus mukorosi, lá 6 ngày tuổi là thích hợp cho cảm ứng tạo phôi. Ở Eucalyptus camaldulensis, lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi cao nhất [70].
Ở nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a), kết quả cho thấy môi trường khống MS có 5 mg/L 2,4-D thích hợp cho ni cấy tạo mơ sẹo và mơ sẹo có khả năng sinh phôi (từ vật liệu LMTB thân rễ) Panax pseudoginseng so với mơi
phơi vơ tính Panax ginseng trực tiếp từ mảnh lá mầm phôi hợp tử, kết quả cho thấy môi trường MS (tỷ lệ NH4+:NO3- là 21:39) là thích hợp nhất (MS có 50 g/L đường, 1% agar) [72].
Đường là yếu tố cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của các thể nuôi cấy mơ trong đó có phơi vơ tính, nồng độ sử dụng phù hợp với nhu cầu của từng loại mô nuôi cấy, dao động từ 20 - 50 g/L. Kim và cộng sự (2012) đã sử dụng 20 - 30 g/L đường cho nuôi cấy phôi thứ cấp Panax ginseng, tùy giai đoạn [73]. Nồng độ đường 50 g/L là thích hợp cho tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo có nguồn gốc từ LMTB cắt ngang thân rễ Panax vietnamensis [74].
Ánh sáng cũng là yếu tố được quan tâm nghiên cứu đặc biệt đối với thể phôi vơ tính đang trong q trình chuyển giai đoạn phát triển hay trong q trình nhân sinh khối. Thơng thường, sử dụng cường độ ánh sáng 4.000 lux để ni cấy. Ni cấy phơi vơ tính sơ cấp Chrysanthemum nhằm tạo phôi thứ cấp được thực hiện ở điều kiện chiếu sáng cường độ cao ~ 4.500 - 7.500 lux (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng cường độ ánh sáng ~ 3.000 lux đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Polyscias filicifolia [5454]. Tuy nhiên, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện tối như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp [76].
Nước dừa (10 - 20% - v/v) cũng được sử dụng trong nghiên cứu liên quan đến phơi vơ tính, vì chứa nhiều chất dinh dưỡng (đường, muối khống, acid amin) và chất ĐHST tự nhiên. Khierallah và Hussein (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa (% - v/v) với nhiều nồng độ khác nhau trên sự tạo mơ sẹo và tái sinh phơi vơ tính
Phoenix dactylifera từ nuôi cấy chồi đỉnh. Kết quả cho thấy tỷ lệ nước dừa 20% là
tốt nhất cho tạo mô sẹo (chỉ tiêu khối lượng tươi) và tái sinh phơi vơ tính (chỉ tiêu số phơi) [77]. Tương tự, Tơ Thị Nhã Trầm và cộng sự (2020) cũng đã sử dụng nước dừa trong tạo mô sẹo và tạo phôi đinh lăng lá xẻ nhỏ (Polyscias fruticosa). Kết quả cho thấy mô sẹo cho tỷ lệ (%) phát sinh phơi vơ tính tối ưu trên mơi trường MS bổ sung 100 mL/L nước dừa kết hợp với 0,5 mg/L BA sau 6 tuần nuôi cấy. Phôi phát sinh từ nuôi cấy mơ sẹo mẫu lá trên mơi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L kinetin kết hợp với 150 mL/L nước dừa cho tỷ lệ tái sinh chồi (%) và số chồi/mẫu cao hơn các nghiệm thức khác sau 8 tuần ni cấy. Ngồi ra, cây in vitro được nuôi cấy trên mơi trường có bổ sung 30 g/L đường và 100 mL/L nước dừa cho số rễ/cây cao nhất [78].
Chất ĐHST là yếu tố mang tính quyết định đến sự hình thành và phát triển phơi vơ tính tái sinh trực tiếp (từ mảnh lá, mảnh lá mầm,..) và gián tiếp (từ mô sẹo hoặc cụm tế bào huyền phù có khả năng sinh phơi). Auxin (IAA, NAA, IBA, 2,4- D,..) và cytokinin (BA, kinetin, TDZ), ngoài tác động ở dạng riêng lẻ, việc kết hợp chúng cũng có tác động trong kích thích tạo phơi. Việc sử dụng 2,4-D là rất cần thiết trong khởi tạo phơi vơ tính và giúp phơi phát triển ở giai đoạn đầu [79]. Ví dụ sản lượng cụm tế bào có khả năng sinh phơi chà là tăng 20 lần nhờ bổ sung 2,4-D nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy [80]. Auxin làm thay đổi biến dưỡng nội sinh theo cách tích cực, ví dụ ở cà rốt, sử dụng 2,4-D làm tăng khả năng đáp ứng sinh phôi qua làm tăng hàm lượng IAA nội sinh; 2,4-D tạo điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [81]. Tiền xử lý thực vật với auxin trước khi thực hiện cảm ứng tạo phôi ở C.
canephora cũng đã làm thay đổi biến dưỡng IAA nội sinh; và trong quá trình cảm
ứng tạo phơi C. canephora có sự gia tăng hàm lượng IAA nội sinh và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tryptophan aminotransferase (tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1; CcTAA1) và enzyme flavin mono-oxygenase (YUCCA; CcYUC1 và
CcYUC3). Cả hai enzyme này tạo sinh tổng hợp IAA (Ayil-Gutiérrez và cộng sự,
2013). NAA (2 mg/L) thích hợp cho ni cấy tạo phơi trực tiếp từ mảnh lá sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [38]. Chất ĐHST khác, như cytokinin cũng tham gia vào sự phát triển của thực vật, kích thích sự hình thành nụ, làm chậm sự lão hóa lá và cùng với auxin kích thích sự phân bào; cả hai auxin và cytokinin có tác động cộng hưởng [82]. Tỷ lệ cao giữa cytokinin và auxin kích thích sự tạo chồi; ngược lại, tỷ lệ này thấp cảm ứng tạo rễ và sự hình thành mơ phân sinh hồn chỉnh ở Pisum sativum. Hai chất ĐHST này hoặc có tác động cộng hưởng hoặc đối kháng trong suốt q trình tạo phơi [83]. Ở C. canephora, sự di chuyển phân cực của IAA là cần thiết cho sự hình thành trục ngọn-gốc [84]. Cytokinin cũng cần thiết để duy trì mức sinh tổng hợp auxin cơ bản trong quá trình phát triển rễ và chồi, do vậy, có thể có một hệ thống điều hịa thống nhất nhằm tạo hàm lượng thích hợp giữa auxin và sự phát triển của thực vật [85].
Q trình hình thành phơi vơ tính có sự tích hợp của các tín hiệu nội sinh và sự tái lập trình gen nhằm giải phóng tín hiệu khởi tạo q trình phát sinh phơi. Các auxin ngoại sinh, ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất ĐHST khác hoặc stress, cảm ứng sự biểu hiện của các gen khác dẫn đến sự thay đổi chương trình di truyền
của tế bào soma và điều hịa q trình dịch chuyển qua từng giai đoạn phát triển của phôi [86]. Hầu hết các gen trên thuộc về một trong 4 nhóm: các yếu tố phiên mã (transcription factors - TFs), các protein tác động ở chu kỳ tế bào, sinh tổng hợp chất ĐHST, chủ yếu là auxin, cũng như các protein tham gia vào con đường tín hiệu [87]. Ở cà rốt (Daucus carota), Michalczuk và cộng sự (1992) đã nghiên cứu các mức auxin nội sinh của tế bào ở các giai đoạn nuôi cấy tạo phôi khác nhau: (1) Nuôi cấy tế bào huyền phù trong mơi trường MS có 1 mg/L 2,4-D; (2) Sau đó chuyển sang ni cấy trong mơi trường khơng có 2,4-D nhằm tạo phơi. Kết quả cho thấy có sự thay đổi con đường sinh tổng hợp IAA trong suốt q trình phát sinh phơi vơ tính. Ở ni cấy huyền phù tế bào tăng sinh trong mơi trường có 2,4-D, nhận thấy IAA nội sinh hình thành đầu tiên từ cơ chất tryptophan, nhưng ở quá trình phát triển của phơi vơ tính, con đường sinh tổng hợp IAA khơng từ tryptophan lại có vai trị nổi trội hơn đối với sinh tổng hợp IAA nội sinh. Như vậy, sự thay đổi về nồng độ auxin ngoại sinh có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp auxin nội sinh - dẫn đến tạo phơi vơ tính [88].
Ribnicky và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin ngoại sinh ở dạng tự do và phức hợp đến biến dưỡng auxin ở nuôi cấy đoạn trụ dưới lá mầm (1 - 2 cm, của cây 7 ngày tuổi từ hạt Daucus carota L. cv Danvers) trên mơi trường MS có hoặc khơng có auxin 2,4-D, [2H4]IAA, NAA (10 mM) và có 250 mM [2H5]L- tryptophan. Kết quả cho thấy 2,4-D kích thích sự hình thành và tăng sinh mơ sẹo, 2,4- D tích lũy ở dạng tự do với lượng lớn và tác động không nhiều lên nồng độ IAA nội sinh. NAA kích thích sự hình thành và tăng sinh mơ sẹo dẫn đến mơ ở trạng thái có thể phát sinh cơ quan – chồi và rễ. NAA được phát hiện chủ yếu ở dạng phức hợp và cũng có tác động khơng nhiều lên nồng độ IAA nội sinh. Như vậy, 2,4-D và NAA đã có tác động trực tiếp lên mơ cấy dẫn đến sự hình thành các loại mô tế bào khác nhau, không do sự thay đổi hàm lượng IAA nội sinh. Không ghi nhận được ảnh hưởng của [2H4]IAA lên mơ cấy có thể do [2H4]IAA bị biến đổi nhanh chóng sang dạng bất hoạt hoặc có thể [2H4]IAA làm giảm nồng độ IAA nội sinh theo cơ chế phản hồi. Sự hiện diện của auxin ngoại sinh đã không gây ảnh hưởng đến tryptophan nội sinh hoặc nguồn (pool) IAA. Như vậy, auxin ngoại sinh không làm thay đổi con đường sinh tổng hợp IAA nhưng cần thiết cho cảm ứng sự hình thành và tăng sinh mơ sẹo cũng như cảm ứng hình thành tế bào có khả năng sinh phơi [89].
Ayil-Gutiérrez và cộng sự (2013) cho rằng hầu hết q trình phát sinh phơi vơ tính địi hỏi sự hiện diện của ít nhất của một loại auxin ngoại sinh, hoặc hiện diện trước đó hoặc hiện diện trong suốt q trình phát sinh phơi; ngồi ra, cịn kể đến vai trò của auxin nội sinh. Auxin ngoại sinh cảm ứng sự hình thành auxin nội sinh – cũng cần thiết cho sự phát sinh phôi. Các tác giả trên đã nghiên cứu động học của nồng độ