CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng
2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc
Sử dụng kết quả của thí nghiệm trên làm cơ sở cho thí nghiệm khảo sát tác động của các chất ĐHST đến sự phát sinh phôi thứ cấp trong mơi trường lỏng. Do đó, mơi trường ni cấy được kế thừa về mơi trường khống, các mức nồng độ của loại auxin có phát sinh phơi tích cực và nồng độ BA; ni cấy lỏng lắc. Sử dụng máy lắc hiệu SARTORIUS của Đức, thực hiện nuôi lỏng lắc với 80 vịng/phút.
Vật liệu ni cấy là các phơi đơn 60 ngày tuổi (từ thí nghiệm tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá).
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác V250 mL, chứa 60 mL môi trường nuôi cấy, ni lỏng lắc 80 vịng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 30 phơi/bình. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về số phơi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái và màu sắc phôi ở 30 NSC.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi phôi
Vật liệu nuôi cấy: sử dụng phôi qua nuôi cấy lỏng lắc sau 60 ngày nuôi cấy từ phôi 60 ngày tuổi của các thí nghiệm tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá.
Để khảo sát ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, sử dụng khối lượng phôi ban đầu như sau: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường ni cấy kế thừa thí nghiệm ảnh hưởng chất ĐHST, 30 g/L đường. Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phơi (lần) và đặc điểm hình thái phơi/cụm phơi ở 30 NSC.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi
2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phơi ni cấy đến sự tạo phơi thứ cấp
Sử dụng vật liệu là các phơi vơ tính với các kích thước khác nhau: kích thước nhỏ (7 - 8 mm), trung bình (~ 10 mm), to (~ 15 mm). Tiến hành cấy 30 phơi nhỏ/trung bình/to vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường ni cấy giống thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phơi ni cấy, có 30 g/L đường.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phơi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/ cụm phơi hình thành ở 30 NSC.
2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phơi 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường như thí nghiệm trên, sucrose được khảo sát với các mức nồng độ (20, 30, 40, 50 g/L); mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phơi (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 45 NSC. Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phơi 0,30 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường như trên, 30 g/L sucrose, nuôi ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: tối (0 lux), chiếu sáng với cường độ 2.000 lux (~ 27 μmol m-2 s-1), 4.000 lux (~ 54 μmol m-2 s-1), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi, thu thập số liệu về
khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phơi (lần), đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 30 NSC. Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp
Các phơi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm) được cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phơi ni cấy trên, 30 g/L sucrose, nước dừa được khảo sát với các mức tỷ lệ (0%, 5%, 10%). Cấy 30 phơi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về số phơi hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 21 NSC.
Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2.4.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
Sử dụng các phơi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm), cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường MS hoặc ½MS (1/2 khống đa lượng) [105] không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, 20 g/L sucrose, cấy 30 phơi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần; quan sát, ghi nhận sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng thành ở 14 NSC. Sau đó, cấy chuyển phơi sang mơi trường đặc thích hợp (kế thừa kết quả thí nghiệm) để phơi phát triển thành cây con trong 60 ngày.
2.4.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp
Cắt tạo các LMTB dọc thân phôi/rễ, ngang phiến lá mầm (của phôi sơ cấp) mang phôi thứ cấp bằng dao lam, mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép của Bộ môn Thực vật - Khoa Dược, ĐH. Y Dược TP. HCM [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định
Số phôi/cụm phôi = Tổng số phôi/số cụm phôi Hệ số nhân phôi = Số phôi/cụm phôi
𝑆ố 𝑝ℎô𝑖 𝑐ấ𝑦/𝑐ụ𝑚
Khối lượng tươi phôi thu nhận (g): Thu và cân sinh khối lượng phôi ở mỗi nghiệm thức sau 30 ngày nuôi.
Hệ số nhân sinh khối phôi (lần) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡ươ𝑖 𝑝ℎô𝑖 𝑡ℎ𝑢 𝑛ℎậ𝑛(𝑔) 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑝ℎô𝑖 𝑛𝑢ô𝑖 𝑐ấ𝑦 (𝑔)
2.5. Nội dung 3. Tạo rễ bất định
2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và mơi trường khống đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá định trực tiếp từ mô lá
Khảo sát tác động của riêng lẻ của auxin và mơi trường khống lên sự cảm ứng tạo rễ bất định của mô lá, nhằm xác định loại và nồng độ auxin thích hợp, trên mơi trường khống thích hợp.
Sử dụng vật liệu là các mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm), cấy úp mặt trên lá tiếp xúc vào mơi trường MS, ½MS, B5 và SH có bổ sung các chất ĐHST riêng lẻ NAA/IBA có cùng nồng độ (0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5) mg/L, 30 g/L sucrose, chiếu sáng 4.000 lux, 12 h chiếu sáng/ngày. Cấy 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về các mức nồng độ của NAA/IBA và yếu tố về mơi trường khống với 4 mơi trường khác nhau (MS, ½MS, B5, SH). Theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) ở thời điểm 30 NSC.
2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
Nhằm khảo sát sự tác động của nồng độ đường đến sự phát sinh rễ từ các mẫu cấy mảnh lá, sử dụng mơi trường khống với chất ĐHST (NAA/IBA) có nồng độ tạo rễ tích cực nhất (kế thừa từ thí nghiệm trên), có đường với các nồng độ khác nhau (20; 30; 40; 50 g/L) làm môi trường nuôi cấy.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm). Mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy trên với 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Theo dõi thí nghiệm, số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) được thu thập ở thời điểm 30 NSC.
2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá lá
Để khảo sát điều kiện chiếu sáng có tác động đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá, tiến hành cấy mẫu trên mơi trường khống, có loại và nồng độ auxin thích hợp, nồng độ sucrose có tác động hiệu quả nhất đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên). Các đĩa mẫu cấy được đặt ở điều kiện chiếu sáng khác nhau 4.000 lux, 2.000 lux, tối hồn tồn.
Sử dụng vật liệu ni cấy là các mảnh lá I (10 x 10 mm) và mảnh lá II (3 x 10 mm). Với mảnh lá I cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; mảnh lá II cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu
nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, ghi nhận số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu (tạo rễ), chiều dài rễ (mm) thu thập ở thời điểm 30 NSC.
2.5.1.4. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá
Cắt dọc các sơ khởi rễ 10 ngày tuổi, dài ~ 4 mm (hình thành trực tiếp ở mặt trên của mảnh lá ni cấy trên mơi trường ½MS có 3 mg/L NAA) tạo LMTB bằng dao lam, vi phẫu được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (độ phóng đại 20X) và chụp hình.
2.5.2. Tạo rễ bất định từ chồi
2.5.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm
Khử trùng mẫu.
Hình 2.3. Vật liệu đốt thân dùng ni cấy tạo chồi.
A. Nhánh cây (vạch ngang là vị trí cắt tạo các đốt thân; CL: cuống lá); B, C. Các đốt
thân dùng ni cấy tạo chồi (mũi tên chỉ vị trí chồi ở trạng thái ngủ) (thanh ngang 10 mm).
Sử dụng nhánh non (8 - 10 cm) cây NGBCC (Hình 2.3 A). Trước hết cắt bỏ lá, rửa nhánh dưới vòi nước chảy trong 10 phút, rửa tiếp bằng nước xà phòng. Cắt nhánh thành các đoạn mang chồi ngủ - đốt nhánh (sau đây gọi là đốt thân) dài ~ 1,5 cm, không sử dụng chồi ngọn, tiếp theo khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, bằng nước Javel 30% (v/v) trong 30 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Các đốt thân, sau khử trùng, cắt bỏ phần mô chết ở hai đầu (Hình 2.3 B, C) được dùng làm vật liệu ni cấy trong thí nghiệm tạo chồi.
Tạo chồi từ đốt thân cây vườn ươm
Cấy các đốt thân sau khử trùng vào mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA và 2 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose [3]. Ghi nhận sự tạo chồi ở 60 NSC.
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi (cao ~ 1 cm) và cấy vào môi trường tạo rễ bất định ½MS có bổ sung 0,2 mg/L NAA [3], 20 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,8; IBA cũng được sử dụng
với nồng độ 0,2 mg/L. Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC.
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố
2.5.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro
Tạo chồi từ đốt thân cây in vitro
Cây in vitro ~ 5 tháng tuổi (có nguồn gốc từ phơi vơ tính được ni trên mơi trường ½MS khơng bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L sucrose) được cắt bỏ tồn bộ lá, sau đó cắt thân thành các đoạn dài ~ 8 mm mang chồi nách và cấy vào môi trường tạo chồi như trên. Theo dõi sự tạo chồi ở 60 NSC.
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi nách 60 ngày tuổi (cao 0,7 - 1 cm), cấy vào môi trường tạo rễ bất định như trường hợp trên. Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC.
2.5.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phơi vơ tính
Sử dụng vật liệu cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính có chiều cao thân ~ 15 mm, cắt bỏ phần rễ trụ, giữ phần thân (trụ dưới lá mầm) và các lá phía trên, dùng như vật liệu tạo rễ bất định. Mẫu được cấy vào mơi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA cùng nồng độ 0,1 mg/L, 20 g/L sucrose. Cấy 2 chồi/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%); số rễ/mẫu; chiều dài rễ (mm) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ tại thời điểm 30 NSC
2.5.3. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = (Số mẫu tạo rễ/số mẫu cấy) x 100% Số rễ/mẫu = Tổng số rễ/số mẫu tạo rễ
Chiều dài rễ (mm) = Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
Các chỉ tiêu của thí nghiệm tạo rễ từ chồi đốt thân cây in vitro được thu thập ở 60 NSC:
Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) = (Số chồi tạo rễ/số chồi cấy) x 100% Số rễ/chồi = Số rễ hình thành/số chồi tạo rễ Chiều dài rễ (mm) = Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
2.6. Nội dung 4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng
2.6.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ
Sử dụng các rễ đơn (rễ sơ cấp, dài ~ 1 cm) tái sinh trực tiếp từ mảnh lá trên mơi trường đặc ½MS có 3 mg/L NAA ở thời điểm 20 NSC làm vật liệu nuôi cấy.
Cấy ~ 120 rễ đơn vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL (~ 0,5% - w/v) mơi trường lỏng ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA với các nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 3 mg/L. Sau 20 ngày nuôi cấy lấy ngẫu nhiên 30 rễ/lần, 3 lần đo đếm, thu thập số liệu về chiều dài rễ sơ cấp (mm), số rễ thứ cấp cấp 1, chiều dài rễ thứ cấp cấp 1 (mm), số rễ thứ cấp (sau đây gọi là rễ nhánh) cấp 2 hình thành và đặc điểm hình thái rễ.
2.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Cấy khối lượng rễ 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường ½MS bổ sung NAA/IBA với nồng độ kế thừa kết quả thí nghiệm (2.6.1); sucrose với các nồng độ (20, 30 và 40 g/L). Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở thời điểm 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố nồng độ sucrose với ba mức nồng độ (20, 30, 40 g/L).
2.6.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng sinh khối rễ, sử dụng khối lượng rễ 0,35 g; 0,70 g; 1,4 g; 2,1 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL mơi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA có nồng độ kế thừa thí nghiệm (2.6.1), nồng độ sucrose được sử dụng từ thí nghiệm (2.6.2). Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố khối lượng rễ nuôi cấy với bốn mức nồng độ (0,35; 0,7; 1,4; 2,1%).
2.6.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian
Cấy khối lượng rễ thích hợp nhất (từ kết quả của thí nghiệm 2.6.3) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL mơi trường ni cấy giống với thí nghiệm (2.6.3). Sau thời gian nuôi cấy 28 ngày, tiến hành thay 70 mL mơi trường ni cấy có thành phần giống môi trường ban đầu. Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) ở 7, 14, 21, 28, 35, 42 và 49 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm
bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố thời gian với các mức thời gian (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 ngày).
2.6.5. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Chiều dài rễ sơ cấp (mm) = Chiều dài các rễ/số rễ được đo
Số rễ nhánh cấp 1 = Số rễ hình thành từ rễ sơ cấp/số rễ sơ cấp Chiều dài rễ nhánh cấp 1 (mm) = Chiều dài của các rễ nhánh/số rễ nhánh Số rễ nhánh cấp 2 = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑟ễ 𝑛ℎá𝑛ℎ ℎì𝑛ℎ 𝑡ℎà𝑛ℎ 𝑡ừ 𝑟ễ 𝑐ấ𝑝 1
𝑆ố 𝑟ễ 𝑛ℎá𝑛ℎ 𝑐ấ𝑝 1
Khối lượng tươi rễ (g): khối lượng rễ tươi thu nhận được 30 NSC Hệ số nhân (lần) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟ễ 𝑡ℎ𝑢 𝑛ℎậ𝑛 (𝑔)
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟ễ 𝑛𝑢ô𝑖 𝑐ấ𝑦 (𝑔)
2.7. Điều kiện ni cấy in vitro
Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng 25 - 28oC, độ ẩm trung bình 50 – 60%, các thí nghiệm đều được đặt ở ngồi sáng để dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, chiếu sáng 12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4.000 lux (trừ thí nghiệm tạo phôi trực tiếp ở điều kiện tối đặt trong điều kiện tối hồn tồn; thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến tăng trưởng sinh khối phơi; thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định ở điều kiện sáng 2.000 lux, ở điều kiện