3.2. Phương pháp
3.2.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng xạ khuẩn
triển vọng
Mục tiêu
Đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối
nhũn trên khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng.
a) Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tiết enzym protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trên mơi trường thạch
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 4 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn có triển vọng.
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Mitra and Chakrabartty (2005); Trần Thị Nhã Uyên (2010):
Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường MS trong 7 ngày, cho 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa, rồi cạo lấy hết bào tử xạ khuẩn, lọc qua vải lược thu thành huyền phù xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng và chà đếm mật số trên môi trường MS. Sau đó pha huyền phù xạ khuẩn về mật số 108 cfu/ml cần dùng.
Xạ khuẩn được cấy thành 2 điểm trên môi trường chứa cơ chất là casein, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn (108 cfu/ml).
Chỉ tiêu theo dõi:
Tiến hành trán dung dịch TCA (Tricloro acid) 10% lên đĩa petri trong 30s. Ghi nhận bán kính vịng phân giải protein sau 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi trán.
b) Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng
Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính enzyme protease được biểu thị là số
20
micromol tyrosin sinh ra do thủy phân bởi casein bởi 1ml dung dịch hay hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,50C, pH là 7,6).
Cách thực hiện: theo phương pháp Anson cải tiến (Trần Thị Nhã
Uyên, 2010):
Các hóa chất cần chuẩn bị:
Dung dịch Na2HPO4 1/15 M. Dung dịch KH2PO4 1/15 M.
Dung dịch đệm soresen 1/15 M, pH 7,6: Trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15 M và 23 ml dung dịch KH2PO4 và đo chuẩn lại pH cho đúng,
Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorensen đến tan hồn tồn rồi sau đó định mức cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA (Tricloro acid) 10%: Hòa tan trong nước. Dung dịch NaOH 0,5 N trong nước.
Dung dịch HCl 0,2 N: Trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 100 ml.
Dung dịch tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền tyrosin trong dung dịch HCl 0,2 N.
Dung dịch tyrosin chuẩn 1 mM/l: Pha loãng 5ml tyrosin 20 mM/l trong HCl 0,2 N thành 100 ml.
Dựng đường chuẩn tyrosin:
Bảng 3.2. Các bước xây dựng đường chuẩn tyrosin
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l(ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2
Thuốc thử folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng tyrosin 20mM/l (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Lắc và để yên 10 phút đem độ mật độ quang (OD) bước sóng 660 nm. Vẽ đồ thị buổi diễn sự biến thiên mật độ quang (delta OD660nm) theo lượng tyrosin ở các ống, với:
Delta Odi660nm= OD660nm ống có nồng độ i tyrosin chuẩn – OD660nm ống khơng có tyrosin chuẩn.
Trong đó: I = 0,1 đến 0,6
21
- Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường MS trong 7 ngày, cho 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa, rồi cạo lấy hết bào tử xạ khuẩn, lọc qua vải lược thu thành huyền phù xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng và chà đếm mật số trên môi trường MS. Sau đó pha huyền phù xạ khuẩn về mật số 108 cfu/ml cần dùng.
- Cho 2 ml huyền phù xạ khuẩn đã chuẩn bị vào trong bình tam giác (thể tích 250 ml) chứa 100 ml môi trường ISP4 lỏng đem nuôi lắc ở điều kiện nhiệt độ phòng với tốc độ 100 vòng/phút.
- Tại các thời điểm 3,5,7 và 9 ngày sau ni lắc thì thu dịch enzyme thơ bằng cách đem ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 15 phút, lấy phần dịch trong bên trên.
Tiến hành thí nghiệm xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu.
Bảng 3.3. Các bước tiến hành định lượng enzym protease có trong dịch trích xạ khuẩn
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Thử thật (4 ống) Thử không (4 ống)
Casein 1% (ml) 5 5
TCA 10% (ml) 0 5
Dịch enzyme thô (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút
TCA 10% (ml) 5 0
Dịch enzyme thô (ml) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5 N
(ml) 2 2
Thuốc thử folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều và để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm
Cách tính kết quả hoạt tính protase (UI/ml):
HT(IU) = (X.V.K)/(t.v) Trong đó:
X: số micromol tyrosin suy ra từ đường chuẩn. V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml).
22 K: độ pha lỗng mẫu (nếu có). T: thời gian phản ứng (30 phút).
1IU (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol/mg/phút
3.2.4 Khảo sát khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng (thí nghiệm 4)
Mục tiêu: nhằm đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp.
gây bệnh thối nhũn trên khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn triển vọng.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 4 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn có triển vọng.
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Ertuğrul et al.
(2007):
- Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường MS trong 7 ngày, cho 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa, rồi cạo lấy hết bào tử xạ khuẩn, lọc qua vải lược thu thành huyền phù xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng và chà đếm mật số trên môi trường MS. Sau đó pha huyền phù xạ khuẩn về mật số 108 cfu/ml cần dùng.
- Xạ khuẩn được cấy thành 2 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn (108 cfu/ml) trên đĩa petri có chứa mơi trường Tween 80 agar.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tiến hành đo bán kính vịng phân giải lipid (vòng kết tủa trắng đục) sau 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi bố trí.
3.2.5 Xử lý số liệu
Số liệu được tổng hợp, xử lý sơ bộ bằng phần mềm Excel. Thống kê phân tích ANOVA và so sánh sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức theo từng cách bố trí thí nghiệm bằng phần mềm MSTATC.
23
Hình 4.1 Khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập được ở một số tỉnh ĐBSCL trên môi trường MS
LV-ĐT15 CM-AG5 CM-AG15 CM-AG22
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN