4.3.1. Khả năng tiết enzym protease trên môi trường thạch
Khả năng phân giải protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trên mơi trường thạch với cơ chất là casein, thơng qua bán kính vịng phân giải protein qua các thời điểm 3, 5, 7 và 9 NSBT (Bảng 4.2).
Ở thời điểm 3 NSBT, tất cả các chủng xạ khuẩn đều bắt đầu thể hiện khả năng phân giải protein thông qua xuất hiện bán kính vịng phân giải khi được trán với thuốc TCA. Hai chủng CM-AG22, LV-ĐT15 có bán kính vịng phân giải cao nhất lần lượt là 5,66 mm và 5,21 mm không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với 2 chủng còn lại.
Đến thời điểm 5 NSBT, khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn tiếp tục tăng, đặc biệt tất cả các chủng xạ khuẩn triển vọng đều có bán kính vịng phân giải lớn hơn 5 mm. Trong đó, chủng CM-AG22 có bán kính vịng phân giải cao là 8,83 mm nhưng khơng khác biệt ý nghĩa thống kê so với hai chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 và DH-TV4 với bán kính vịng phân giải lần lượt là 8,51 mm; 8,19 mm. Thấp nhất là chủng LV-ĐT24 với bán kính vịng phân giải là 6,15 mm
Bảng 4.3 Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn qua các thời điểm
Nghiệm thức Bán kính vịng phân giải protein (mm)
3 NSBT 5 NSBT 7 NSBT 9 NSBT LV-ĐT15 5,21 a 8,51 ab 11,05 a 12,53 c CM-AG22 5,66 a 8,83 a 10,80 a 15,08 a DH-TV4 4,50 b 8,19 b 12,12 a 14,25 b LV-ĐT24 3,86 b 6,15 c 10,47 a 12,18 c Mức ý nghĩa ** ** ns ** CV (%) 10,67 5,57 11,15 3,19
Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì khơng khác biệt qua phép kiểm định Duncan, : ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Ở thời điểm 7 NSKC, khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn trên môi trường chứa cơ chất là casein vẫn tiếp tục có xu hướng tăng, với bán kính dao động từ 10,47 mm – 12,12 mm. Tuy nhiên giữa các chủng xạ khuẩn không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau ở mức 1%.
29
Ở thời điểm 9 NSBT, tất cả các chủng xạ khuẩn đều có bán kính vịng phân giải trên 12 mm. Trong đó, chủng CM-AG22 vẫn duy trì khả năng phân giải protein cao nhất với bán kính vịng phân giải là 15,08 mm khác biệt ý nghĩa thống kê với các tất cả các chủng cịn lại. Tiếp đó, chủng xạ khuẩn DH- TV4 có bán kính vịng phân giải cao là 14,25 mm . Ngoài ra, chủng LV – ĐT24 và LV-ĐT15 cũng có bán kính vịng phân giải khá ổn định lần lượt là 12,53 mm và 12,18 mm.
Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn có triển vọng đều có bán kính vịng phân giải protein và khả năng phân giải tăng dần theo thời gian. Trong đó, chủng CM-AG22 duy trì khả năng phân giải protein cao, đặc biệt ở thời điểm 9 NSBT với bán kính vịng phân giải là 15,08 mm khác biệt ý nghĩa thống kê 1% với các tất cả các chủng còn lại. Kết quả này một lần nữa khẳng định khả năng tiết enzyme protease của xạ khuẩn là phổ biến. Theo Nguyễn Thị Mỹ Ngân (2014), 8 chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn Xanthomonasoryzae
pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện phịng thí nghiệm đều có khả năng tiết enzyme protease. Gần đây, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Như Ý (2016), đã ghi nhận 6 chủng xạ khuẩn TTr44, TĐ16, TT17, TT9, TT11, và TT15 đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khoai lang đều có khả năng tiết enzyme protease. Trong đó, chủng TTr44 có bán kính vịng phân giải protein cao nhất tại các thời điểm và đặc biệt ở thời điểm 9 NSBT với bán kính phân giải là 14,52 mm.
Như vậy, có thể thấy 4 xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT15, DH-TV4 và LV-ĐT24 có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme protease phân giải protein trên vách tế bào mầm bệnh mà cụ thể ở đây là vi khuẩn có vách tế bào cấu tạo bởi thành phần chính là protein (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Vì vậy,
Hình 4.3 Vịng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn ở thời điểm 9 NSBT
30
khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của xạ khuẩn cũng là một hướng triển vọng trong phòng trị các bệnh do vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng.
4.3.2 Hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn trong môi trường lỏng
Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (Delta OD) theo lượng tyrosin ở các ống được trình bày ở phụ hình 1 và phụ bảng 18.
Bảng 4.4 Hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn ở các thời điểm sau khi nuôi lắc
Xạ khuẩn Hàm lượng protease ( IU/ml)
3NSNL 5NSNL 7NSNL 9NSNL LV-ĐT15 0,014 d 0,020 b 0,032 c 0,004 c CM-AG22 0,109 a 0,129 a 0,179 a 0,149 a DH-TV4 0,026 c 0,032 b 0,043 c 0,009 c LV-ĐT24 0,093 b 0,142 a 0,090 b 0,030 b Mức ý nghĩa ** ** ** ** CV (%) 8,37 12,27 8,64 8,21
Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì khơng khác biệt qua phép kiểm định Duncan, : ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Kết quả ghi nhận ở bảng 4.2 cho thấy các chủng xạ khuẩn khảo sát đều cho có khả năng tiết protease ở mức độ khác nhau.
Ở thời điểm 3 NSNL, các chủng xạ khuẩn đều bắt đầu tiết protease với hàm lượng dao động từ 0,014 – 0,109 IU/ml. Trong đó, chủng CM-AG22 có hàm lượng protease tiết cao nhất 0,109 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê 1% với các chủng xạ khuẩn còn lại.
Đến thời điểm 5 NSNL, hàm lượng protease các chủng xạ khuẩn tiếp tục tăng. Trong đó, chủng xạ khuẩn LV-ĐT24 và CM-AG22 lần lượt có hàm lượng protease tiết ra là 0,142 UI/ml và 0,129 UI/ml không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn còn lại.
Ở thời điểm 7 NSNL, 3 chủng xạ khuẩn CM-AG22, DH-TV4 và LV- ĐT15 với hàm lượng protease vẫn tiếp tục tăng, dao động trong khoảng 0,032 – 0,179 UI/ml. Trong đó hàm lượng protease tiết ra cao nhất là ở chủng CM- AG22 với 0,179 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê so với các chủng xạ khuẩn cịn lại. Tuy hàm lượng protase của chủng LV-ĐT24 có xu hướng giảm so với các thời điểm trước nhưng với hàm lượng protease tiết ra là 0,090 UI/ml cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với 2 chủng xạ khuẩn còn lại.
31
Đến thời điểm 9 NSNL, khả năng tiết protease của các chủng xạ khuẩn đều giảm mạnh, hàm lượng protease dao động từ 0,004 – 0,149 UI/ml. Trong đó, chủng xạ khuẩn CM-AG22 vẫn giữ khả năng tiết cao nhất với hàm lượng protease là 0,149 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê so với ba chủng xạ khuẩn còn lại. Tiếp đó là chủng LV-ĐT24 có hàm lượng protease tiết ra là 0,030 UI/ml cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn DH-TV4 và LV-ĐT15.
Tóm lại, qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy, các chủng xạ khuẩn đều có khả năng tiết protease với hàm lượng protease đa phần có xu hướng tăng dần ở các thời điểm 3, 5 và 7 NSNL; riêng đến thời điểm 9 NSNL đã giảm mạnh. Trong đó, chủng xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT24 duy trì khả năng tiết protease cao qua các thời điểm khảo sát khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn còn lại. Đặc biệt ở 7 NSNL, chủng CM-AG22 với hàm lượng protase tiết nhiều nhất được ghi nhận là 0,179 UI/ml. Theo Huỳnh Nguyễn Triều Vỹ (2016), khảo sát các chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa cho thấy có 6 chủng
xạ khuẩn đều có khả năng phân giải protein. Trong 6 chủng ST1, KG5, BL6, BL7, ST9 và ST12 thì chủng xạ khuẩn có hoạt tính protease cao nhất là ST1 với hàm lượng protease đo đạt được là 0,387 IU/ml.
Chính vì vậy, cho thấy mà khả năng tiết protease của xạ khuẩn triển vọng trong phịng trị bệnh thối nhũn trên củ khoai mơn có xu hướng tăng giảm không đều qua các thời điểm nuôi lắc. Cụ thể là, 3 chủng xạ khuẩn CM-AG22, DH-TV4 và LV-ĐT15 có hàm lượng protease tiết cao nhất ở thời điểm 7
Hình 4.4 Sự biến thiên mật độ quang giữa các ống ở thời điểm 7 NSNL
32
NSNL, riêng chỉ có chủng LV-ĐT24 với hàm lượng protease tiết cao ở thời điểm 5 NSNL. Đến thời điểm 9 NSNL, các chủng xạ khuẩn này với hàm lượng protease tiết ra đều có xu hướng giảm mạnh.
Sở dĩ có sự biến động đó là do theo nhiều nghiên cứu đã báo cáo thì quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như q trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. Trong đó, thời gian ni cấy là một yếu tố quyết định hoạt tính protease cao hay thấp. Hay nói một cách cụ thể, thời gian hoạt động protease vi khuẩn phụ thuộc vào độ bền hoạt tính protease. Thơng thường, hoạt tính protease có thể giữ được trong 60 – 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian. Hoạt động của protesae chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy lồi vi khuẩn (trích dẫn bởi Tống Ngọc Triêm, 2010).
Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2008) nếu thời gian kéo dài xạ khuẩn sẽ chuyển sang giai đoạn suy vong, số bào tử chết đi lớn hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trưởng được nữa. Do đó, nếu kéo dài thời gian ni cấy xạ khuẩn thì khơng cịn khả năng sinh enzyme theo mong muốn làm hoạt tính protease có xu hướng giảm.
Hình 4.5 Sự biến thiên hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn tiết ra qua các thời điểm nuôi lắc
33