4.3.1. Khả năng tiết enzym protease trên môi trường thạch
Khả năng phân giải protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trên môi trường thạch với cơ chất là casein, thông qua bán kính vòng phân giải protein qua các thời điểm 3, 5, 7 và 9 NSBT (Bảng 4.2).
Ở thời điểm 3 NSBT, tất cả các chủng xạ khuẩn đều bắt đầu thể hiện khả năng phân giải protein thông qua xuất hiện bán kính vòng phân giải khi được trán với thuốc TCA. Hai chủng CM-AG22, LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải cao nhất lần lượt là 5,66 mm và 5,21 mm không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với 2 chủng còn lại.
Đến thời điểm 5 NSBT, khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn tiếp tục tăng, đặc biệt tất cả các chủng xạ khuẩn triển vọng đều có bán kính vòng phân giải lớn hơn 5 mm. Trong đó, chủng CM-AG22 có bán kính vòng phân giải cao là 8,83 mm nhưng không khác biệt ý nghĩa thống kê so với hai chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 và DH-TV4 với bán kính vòng phân giải lần lượt là 8,51 mm; 8,19 mm. Thấp nhất là chủng LV-ĐT24 với bán kính vòng phân giải là 6,15 mm
Bảng 4.3 Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn qua các thời điểm
Nghiệm thức Bán kính vòng phân giải protein (mm)
3 NSBT 5 NSBT 7 NSBT 9 NSBT LV-ĐT15 5,21 a 8,51 ab 11,05 a 12,53 c CM-AG22 5,66 a 8,83 a 10,80 a 15,08 a DH-TV4 4,50 b 8,19 b 12,12 a 14,25 b LV-ĐT24 3,86 b 6,15 c 10,47 a 12,18 c Mức ý nghĩa ** ** ns ** CV (%) 10,67 5,57 11,15 3,19
Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, : ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Ở thời điểm 7 NSKC, khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn trên môi trường chứa cơ chất là casein vẫn tiếp tục có xu hướng tăng, với bán kính dao động từ 10,47 mm – 12,12 mm. Tuy nhiên giữa các chủng xạ khuẩn không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau ở mức 1%.
29
Ở thời điểm 9 NSBT, tất cả các chủng xạ khuẩn đều có bán kính vòng phân giải trên 12 mm. Trong đó, chủng CM-AG22 vẫn duy trì khả năng phân giải protein cao nhất với bán kính vòng phân giải là 15,08 mm khác biệt ý nghĩa thống kê với các tất cả các chủng còn lại. Tiếp đó, chủng xạ khuẩn DH- TV4 có bán kính vòng phân giải cao là 14,25 mm . Ngoài ra, chủng LV – ĐT24 và LV-ĐT15 cũng có bán kính vòng phân giải khá ổn định lần lượt là 12,53 mm và 12,18 mm.
Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn có triển vọng đều có bán kính vòng phân giải protein và khả năng phân giải tăng dần theo thời gian. Trong đó, chủng CM-AG22 duy trì khả năng phân giải protein cao, đặc biệt ở thời điểm 9 NSBT với bán kính vòng phân giải là 15,08 mm khác biệt ý nghĩa thống kê 1% với các tất cả các chủng còn lại. Kết quả này một lần nữa khẳng định khả năng tiết enzyme protease của xạ khuẩn là phổ biến. Theo Nguyễn Thị Mỹ Ngân (2014), 8 chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn Xanthomonasoryzae
pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm đều có khả năng tiết enzyme protease. Gần đây, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Như Ý (2016), đã ghi nhận 6 chủng xạ khuẩn TTr44, TĐ16, TT17, TT9, TT11, và TT15 đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khoai lang đều có khả năng tiết enzyme protease. Trong đó, chủng TTr44 có bán kính vòng phân giải protein cao nhất tại các thời điểm và đặc biệt ở thời điểm 9 NSBT với bán kính phân giải là 14,52 mm.
Như vậy, có thể thấy 4 xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT15, DH-TV4 và LV-ĐT24 có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme protease phân giải protein trên vách tế bào mầm bệnh mà cụ thể ở đây là vi khuẩn có vách tế bào cấu tạo bởi thành phần chính là protein (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Vì vậy,
Hình 4.3 Vòng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn ở thời điểm 9 NSBT
30
khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của xạ khuẩn cũng là một hướng triển vọng trong phòng trị các bệnh do vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng.
4.3.2 Hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn trong môi trường lỏng
Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (Delta OD) theo lượng tyrosin ở các ống được trình bày ở phụ hình 1 và phụ bảng 18. Bảng 4.4 Hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn ở các thời điểm sau khi nuôi lắc
Xạ khuẩn Hàm lượng protease ( IU/ml)
3NSNL 5NSNL 7NSNL 9NSNL LV-ĐT15 0,014 d 0,020 b 0,032 c 0,004 c CM-AG22 0,109 a 0,129 a 0,179 a 0,149 a DH-TV4 0,026 c 0,032 b 0,043 c 0,009 c LV-ĐT24 0,093 b 0,142 a 0,090 b 0,030 b Mức ý nghĩa ** ** ** ** CV (%) 8,37 12,27 8,64 8,21
Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, : ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Kết quả ghi nhận ở bảng 4.2 cho thấy các chủng xạ khuẩn khảo sát đều cho có khả năng tiết protease ở mức độ khác nhau.
Ở thời điểm 3 NSNL, các chủng xạ khuẩn đều bắt đầu tiết protease với hàm lượng dao động từ 0,014 – 0,109 IU/ml. Trong đó, chủng CM-AG22 có hàm lượng protease tiết cao nhất 0,109 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê 1% với các chủng xạ khuẩn còn lại.
Đến thời điểm 5 NSNL, hàm lượng protease các chủng xạ khuẩn tiếp tục tăng. Trong đó, chủng xạ khuẩn LV-ĐT24 và CM-AG22 lần lượt có hàm lượng protease tiết ra là 0,142 UI/ml và 0,129 UI/ml không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn còn lại.
Ở thời điểm 7 NSNL, 3 chủng xạ khuẩn CM-AG22, DH-TV4 và LV- ĐT15 với hàm lượng protease vẫn tiếp tục tăng, dao động trong khoảng 0,032 – 0,179 UI/ml. Trong đó hàm lượng protease tiết ra cao nhất là ở chủng CM- AG22 với 0,179 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê so với các chủng xạ khuẩn còn lại. Tuy hàm lượng protase của chủng LV-ĐT24 có xu hướng giảm so với các thời điểm trước nhưng với hàm lượng protease tiết ra là 0,090 UI/ml cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với 2 chủng xạ khuẩn còn lại.
31
Đến thời điểm 9 NSNL, khả năng tiết protease của các chủng xạ khuẩn đều giảm mạnh, hàm lượng protease dao động từ 0,004 – 0,149 UI/ml. Trong đó, chủng xạ khuẩn CM-AG22 vẫn giữ khả năng tiết cao nhất với hàm lượng protease là 0,149 UI/ml khác biệt ý nghĩa thống kê so với ba chủng xạ khuẩn còn lại. Tiếp đó là chủng LV-ĐT24 có hàm lượng protease tiết ra là 0,030 UI/ml cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn DH-TV4 và LV-ĐT15.
Tóm lại, qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy, các chủng xạ khuẩn đều có khả năng tiết protease với hàm lượng protease đa phần có xu hướng tăng dần ở các thời điểm 3, 5 và 7 NSNL; riêng đến thời điểm 9 NSNL đã giảm mạnh. Trong đó, chủng xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT24 duy trì khả năng tiết protease cao qua các thời điểm khảo sát khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn còn lại. Đặc biệt ở 7 NSNL, chủng CM-AG22 với hàm lượng protase tiết nhiều nhất được ghi nhận là 0,179 UI/ml. Theo Huỳnh Nguyễn Triều Vỹ (2016), khảo sát các chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa cho thấy có 6 chủng xạ khuẩn đều có khả năng phân giải protein. Trong 6 chủng ST1, KG5, BL6, BL7, ST9 và ST12 thì chủng xạ khuẩn có hoạt tính protease cao nhất là ST1 với hàm lượng protease đo đạt được là 0,387 IU/ml.
Chính vì vậy, cho thấy mà khả năng tiết protease của xạ khuẩn triển vọng trong phòng trị bệnh thối nhũn trên củ khoai môn có xu hướng tăng giảm không đều qua các thời điểm nuôi lắc. Cụ thể là, 3 chủng xạ khuẩn CM-AG22, DH-TV4 và LV-ĐT15 có hàm lượng protease tiết cao nhất ở thời điểm 7
Hình 4.4 Sự biến thiên mật độ quang giữa các ống ở thời điểm 7 NSNL
32
NSNL, riêng chỉ có chủng LV-ĐT24 với hàm lượng protease tiết cao ở thời điểm 5 NSNL. Đến thời điểm 9 NSNL, các chủng xạ khuẩn này với hàm lượng protease tiết ra đều có xu hướng giảm mạnh.
Sở dĩ có sự biến động đó là do theo nhiều nghiên cứu đã báo cáo thì quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. Trong đó, thời gian nuôi cấy là một yếu tố quyết định hoạt tính protease cao hay thấp. Hay nói một cách cụ thể, thời gian hoạt động protease vi khuẩn phụ thuộc vào độ bền hoạt tính protease. Thông thường, hoạt tính protease có thể giữ được trong 60 – 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian. Hoạt động của protesae chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn (trích dẫn bởi Tống Ngọc Triêm, 2010).
Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2008) nếu thời gian kéo dài xạ khuẩn sẽ chuyển sang giai đoạn suy vong, số bào tử chết đi lớn hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trưởng được nữa. Do đó, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy xạ khuẩn thì không còn khả năng sinh enzyme theo mong muốn làm hoạt tính protease có xu hướng giảm.
Hình 4.5 Sự biến thiên hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn tiết ra qua các thời điểm nuôi lắc
33
4.4 Khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng
Qua kết quả bảng 4.4 cho ta thấy các chủng xạ khuẩn thí nghiệm đều có khả năng tiết enzyme lipase để phân giải lipid trên môi trường Tween 80 agar.
Bảng 4.5 khả năng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn qua các thời điểm
STT Xạ khuẩn Bán kính vòng phân giải lipid (mm)
3 NSBT 5 NSBT 7 NSBT 9 NSBT 1 LV-ĐT15 5,09 a 8,53 a 11,14 a 14,05 a 2 CM-AG22 4,39 ab 6,97 b 10,87 ab 13,75 a 3 DH-TV4 3,84 b 5,35 c 9,72 c 11,71 b 4 LV-ĐT24 3,08 c 4,64 c 9,95 bc 12,34 b Mức ý nghĩa ** ** ** ** CV (%) 9,31 10,18 4,83 4,91
Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, : ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Thời điểm 3 NSBT, tất cả các chủng xạ đều cho khả năng phân giải lipid thông qua sự xuất hiện vòng phân giải (vòng đục), bán kính vòng phân giải dao động từ 3,08 – 5,09 mm. Chủng LV-ĐT15 tuy có bán kính vòng phân giải không khác biệt ý nghĩa thống kê; nhưng có bán kính vòng phân giải cao hơn là 5,09 mm cao hơn so với 3 chủng xạ khuẩn còn lại.
Đến thời điểm 5 NSBT, các chủng xạ khuẩn có bán kính vòng phân giải lipid tiếp tục tăng cao. Trong đó, chủng LV-ĐT15 có khả năng tiết enzyme lipase cao nhất với bán kính vòng phân giải là 8,53 mm. Tiếp đó là chủng CM-AG22 với bán kính vòng phân giải là 6,97 mm khác biệt ý nghĩa thống kê với hai chủng xạ khuẩn còn lại.
Hình 4.6 Vòng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn ở thời điểm 9 NSBT CM-AG22
34
Ở thời điểm 7 NSBT, khả năng phân giải lipid của bốn chủng xạ khuẩn tăng vượt trội, dao động trong khoảng 9,95 – 10,87 mm. Tuy chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải không khác biệt ý nghĩa thống kê nhưng có bán kính vòng phân giải cao hơn là 11,14 mm so với 3 chủng xạ khuẩn còn lại là CM-AG22, DH-TV4, LV-ĐT24.
Ở thời điểm 9 NSBT, vòng phân giải lipid vẫn tiếp tục tăng lên, dao động từ 11,71 – 14,05 mm. Trong đó, chủng LV-ĐT15 vẫn duy trì khả năng tiết lipase cao nhất, với bán kính vòng phân giải là 14,05 mm tuy không khác biệt ý nghĩa so với chủng CM-AG22 có bán kính vòng phân giải là 13,75 mm nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê so hai chủng xạ khuẩn còn lại. Chủng DH- TV4 và LV-ĐT24 với bán kính vòng phân giải lần lượt là 11,71 mm và 12,34 mm.
Nhìn chung, qua kết quả thí nghiệm 4 cho thấy các chủng xạ khuẩn triển vọng đều có khả năng tiết enzyme lipase và tăng dần qua các thời điểm. Trong đó, 2 chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 và CM-AG22 có bán kính vòng phân giải lipid cao lần lượt là 14,05 mm và 13,75mm ở thời điểm 9 NSBT.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Như Ý (2017) có 6 chủng xạ khuẩn là TT9, TT11, TT15, TTr44, TĐ16 và TT17 đều có khả năng tiết enzym lipase để đối kháng bệnh héo xanh trên khoai lang do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, với bán kính vòng phân giải của các chủng xạ khuẩn dao động từ 9,96 - 13,80 mm ở thời điểm 9 NSBT. Trong đó, 6 chủng TT9, TT11, TT15, TTr44, TĐ16 và TT17 với bán kính vòng phân giải lần lượt là 12,60 mm; 13,80 mm; 13,40 mm; 9,96 mm; 12,97 mm và 12,25 mm.
Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác của Huỳnh Hào Quang (2017), cho thấy 6 chủng xạ khuẩn CT07-HG, LM13-HG, CT09-HG, CTA1-HG, HB3-BL và CT2-HG đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri gây bệnh loét trên cam, quýt cũng có khả năng tiết enzym lipase trên môi trường Tween 80 agar và có bán kính vòng phân giải tăng dần qua các thời điểm. Trong đó, chủng CTA1-HG có bán kính vòng phân giải lipid cao nhất là 14,50 mm ở thời điểm 8 NSBT.
Ngoài ra, theo Nguyễn Lân Dũng (2005), lipid là thành phần quan trọng của màng sinh chất hay màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Do đó, kết quả thí nghiệm đã chứng minh rằng 4 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thông qua cơ chế tiết enzyme lipase phân giải lipid của màng sinh chất hay màng tế bào chất ở vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên khoai
35
môn. Như vậy, việc ức chế và tiêu diệt mầm bệnh thông qua cơ chế tiết enzyme lipase phân giải lipid trên vách tế bào của mầm bệnh của xạ khuẩn là có khả năng và đáng xem xét.
36
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Có 20 trong tổng số 126 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cây khoai môn. Trong đó, 4 chủng CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 và DH-TV4 có bán kính vòng vô khuẩn cao lần lượt là 8,32 mm, 6,40 mm, 5,82 mm và 4,37 mm đến thời điểm 7 NSBT.
Cả 4 chủng xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 và DH-TV4 đều có khả năng phân giải protease (casein) trên môi trường thạch và tiết enzyme protease trên môi trường ISP4 lỏng. Trong đó, chủng CM-AG22 cho thấy khả năng tiết enzyme protease cao nhất trên 2 loại môi trường khảo sát với bán kính vòng phân giải là 15,08 và hàm lượng protease tiết ra là 0,149 UI/ml ở thời điểm 9 NSBT. Đồng thời, chủng LV-ĐT24 cũng có hàm lượng protease tiết ra cao là 0,030 UI/Ml ở thời điểm 9 NSBT.
Cả 4 chủng xạ khuẩn này đều có khả năng phân giải lipase trên môi