bệnh sinh của bệnh Alzheimer
Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc trên một số đích liên quan đến ba giả thuyết quan trọng hiện nay về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer là giả thuyết cholinergic, giả thuyết β-amyloid và giả thuyết stress oxy hóa bao gồm:
1.3.3.1.Phương pháp đánh giá tác dụng liên quan đến giả thuyết cholinergic
- Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Khả năng ức chế enzym AChE được đánh giá qua hoạt độ enzym AChE theo phương pháp của Ellman G. L. và cộng sự. Về nguyên tắc, enzym AChE thủy phân cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) tạo ra thiocholin có khả năng phản ứng với acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất có màu vàng, được đo mật độ quang tại 412nm [56]. Chi tiết phản ứng được trình bày trong hình 1.9.
27
- Xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE in vitro
Đặc điểm động học ức chế enzym AChE in vitro được xác định thông qua xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk biểu thị biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất để xác định kiểu động học ức chế enzym AChE, cụ thể là mối tương quan giữa (1/nồng độ cơ chất ATCI, ký hiệu là 1/[ATCI]) và (1/tốc độ phản ứng, ký hiệu là 1/v); và đồ thị Dixon biểu thị mối tương quan giữa nồng độ chất ức chế và tốc độ phản ứng để xác định hằng số ức chế enzym (Ki). Giá trị Ki thể hiện nồng độ của chất ức chế để ức chế 50% hoạt độ enzym AChE [30], [56], [180], [227]. Chi tiết phân loại động học ức chế enzym được trình bày trong phụ lục 11.
1.3.3.2.Phương pháp đánh giá tác dụng liên quan đến giả thuyết β-amyloid
Trên thực nghiệm, β-amyloid25-35 sau khi hoạt hóa sẽ ngưng tụ lại gây giảm khả năng sống sót của tế bào [25], [33], [132]; được xác định theo phương pháp MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid). Về nguyên tắc, enzym hydrogenase ở ty thể của những tế bào sống có khả năng phân giải vòng tetrazolium của MTT thành tinh thể formazan màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm [129], [183], [236]. Chi tiết được trình bày trong hình 1.10.
Hình 1.10. Nguyên tắc xác định tỷ lệ tế bào sống sót [129]
1.3.3.3.Phương pháp đánh giá tác dụng liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
- Tác dụng ức chế q trình peroxid hóa lipid trong mơ não chuột
Malondialdehyd (MDA) là sản phẩm giáng hóa của các phản ứng peroxid hóa các acid béo khơng bão hịa. Vì vậy, MDA được coi là marker quan trọng của q trình peroxid hóa lipid [23], [136]. Định lượng hàm lượng MDA trong mô não chuột theo phương pháp của Wasowicz W. [222]. Về nguyên tắc, MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric trong môi trường acid, tạo ra hợp chất trimethin màu hồng có độ hấp thụ cực đại ở 532 nm. Chi tiết được trình bày trong hình 1.11.
28
Hình 1.11. Nguyên tắc định lượng hàm lượng MDA trong mô não chuột [222]
- Tác dụng dọn gốc tự do in vitro
Gốc tự do là các chất oxy hóa mạnh, phản ứng rất cao và có khả năng thúc đẩy stress oxy hóa dẫn đến tổn thương, thối hóa và chết tế bào thần kinh [107], [210]. Các chất có khả năng dọn gốc tự do DPPH và superoxid có ý nghĩa trong nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Alzheimer.
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền có khả năng tan trong methanol tạo dung dịch màu tím có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 517 nm. Khi phản ứng với chất chống oxy hóa, DPPH sẽ chuyển thành dạng khử và mất màu tím [94], [142]. Nguyên tắc phản ứng được trình bày trong hình 1.12.
Hình 1.12. Nguyên tắc phương pháp đánh giá tác dụng dọn gốc DPPH [94]
Superoxid (O2∙-) là gốc anion tự do được hình thành do enzym xanthin oxydase xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin trong cơ thể [229]. Quá trình tạo gốc dưới tác động của hệ xanthin/xanthin oxidase được trình bày trong hình 1.13.
Hình 1.13. Phản ứng tạo gốc superoxid [229]
Trong các nghiên cứu, khả năng dọn gốc superoxid thường được đánh giá bằng nitro blue tetrazolium (NBT). Gốc O2∙- tạo thành có khả năng phản ứng với NBT tạo ra formazan NBT có màu hồng nhạt với độ hấp thụ cực đại ở 560 nm. Khi có mặt của chất có khả năng ức chế gốc tự do superoxid sẽ làm giảm sự hình thành của sản phẩm này [218], [229].
29