2.1.1.Dược liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Rễ của cây Đan sâm di thực, thu hái tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La (Tọa độ: 20,9089oB; 104,6377oN) vào tháng 12 năm 2017, có độ tuổi trung bình 1 năm. Cây Đan sâm được giám định tên khoa học là
Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà – Lamiaceae (Phụ lục 1). Các tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại Bảo tàng thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên với số hiệu tiêu bản HNU 022613; và tại phòng Thực vật học, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với số hiệu tiêu bản DSL2668 (phụ lục 2). Hình ảnh của cây Đan sâm được trình bày trong hình 2.1.
Hình 2.1. Cây Đan sâm di thực thu hái tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La
1- Toàn cây, 2- Lá kép, 3- Lá chét, 4- Chùm hoa, 5- Hoa, 6- Rễ khi thu hoạch
Bảo quản: Rễ cây Đan sâm được loại bỏ phần rễ con, rửa sạch, phơi, sấy ở 55oC; rồi nghiền bằng máy nghiền, sàng qua rây (kích thước lỗ 2 mm) thu được bột thơ. Bột rễ Đan sâm được bảo quản trong túi nilon kín để nơi khơ ráo, thống mát.
35
Định tính và định lượng các nhóm chất chính trong dược liệu: Tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng các nhóm chất chính trong rễ Đan sâm di thực theo Dược điển Việt Nam V [3]. Kết quả định tính và định lượng bằng HPLC ghi nhận rễ Đan sâm đạt tiêu chuẩn về hàm lượng tanshinon IIA (0,61%) và acid salvianolic B (8,69%) theo Dược điển Việt Nam V (phụ lục 3 và 4).
2.1.2.Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
Chiết xuất cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực (EĐS): Cân 10,0 kg bột thô rễ Đan sâm (hàm ẩm: 9,4%), thêm 5 lit ethanol 95% để yên trong 24 giờ, rồi thêm 100 lit ethanol 95% và ngâm trong 10 ngày; rút dịch chiết với tốc độ 1,5 lit/giờ và bổ sung dung mơi đến khi dịch chiết thu được có màu vàng nhạt thì dừng lại. Gộp dịch chiết ethanol thu được khoảng 200 lit, rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 55°C, cô trên nồi cách thủy, sấy chân không ở 55°C thu được 1520,20 g cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm (hàm ẩm 10,6%). Hiệu suất chiết đạt 15,0%.
Chiết xuất cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực (HĐS):
- Tiến hành khảo sát chiết phân đoạn cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm với các dung mơi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan, ethylacetat, n-butanol và định lượng hàm lượng các hoạt chất chính bao gồm tanshinon IIA và acid salvianolic B trong các phân đoạn này (chi tiết được trình bày trong phụ lục 5). Kết quả cho thấy phân đoạn n-hexan có hàm lượng tanshinon IIA cao nhất nên được lựa chọn làm mẫu nghiên cứu tiếp theo.
- Lấy khoảng ½ khối lượng cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm, cân được 734,16 g đem phân tán trong nước cất với tỷ lệ khối lượng cao: thể tích nước là 1:2 thu được hỗn dịch cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm. Sau đó đem chiết phân đoạn với n-hexan theo tỷ lệ hỗn dịch cao: n-hexan là 1:5, lặp lại 3 lần. Gộp phân lớp n- hexan, sau đó cơ thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm ở 55°C, cô trên nồi cách thủy rồi sấy chân không ở 55°C thu được 19,74 g cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm (hàm ẩm 2,8%). Hiệu suất chiết đạt 2,9%. Quy trình chiết xuất cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm được thể hiện chi tiết trong hình 2.2.
36
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn
n-hexan rễ Đan sâm di thực Bột rễ Đan Sâm
(Khối lượng: 10,0 kg; hàm ẩm: 9,4%)
Dịch chiết ethanol
- Chiết bằng ethanol 95%
Cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm (EĐS)
(Khối lượng: 1520,20 g; hàm ẩm: 10,6%)
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Cô trên nồi cách thủy, sấy chân không ở 55°C
Lưu mẫu EĐS (786,04 g)
Chiết phân đoạn EĐS (Khối lượng: 734,16 g,
hàm ẩm: 10,6%)
- Hòa EĐS trong nước cất, tỷ lệ 1:2 - Lắc hỗn dịch EĐS với n-hexan, tỷ lệ 1:5, lặp lại 3 lần
Phân lớp n-hexan
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan Sâm (HĐS) (Khối lượng: 19,74 g; hàm ẩm: 2,8%) Phân lớp nước Cắn nước (Khối lượng: 701,54 g; hàm ẩm: 19,4%) Loại bỏ ethanol 95 %
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Cô trên nồi cách thủy, sấy chân không ở 55°C Loại bỏ
n-hexan - Cô trên nồi
cách thủy, sấy chân không ở 65°C
Loại bỏ nước
37
Đặc điểm của mẫu nghiên cứu: Cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n- hexan rễ Đan sâm di thực sau khi chiết xuất được xác định các đặc điểm theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V với các tiêu chí gồm: Hàm ẩm, định tính, tro tồn phần, tro không tan trong acid và định lượng hàm lượng hoạt chất tanshinon IIA và acid salvianolic B [3]. Trong đó, cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm có hàm ẩm là 9,4%, hàm lượng tanshinon IIA đạt 3,1% và acid salvianolic B đạt 11,6%. Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm có hàm ẩm là 2,8%, hàm lượng tanshinon IIA đạt 5,6% và acid salvianolic B là 3,0%. Kết quả chi tiết được trình bày trong phụ lục 6.
Dựa vào hiệu suất chiết cao phân đoạn n-hexan từ cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm và quá trình thăm dị liều thực tế, nhóm nghiên cứu đã tiến hành quy đổi liều như sau: Tính theo khối lượng khơ kiệt, 656,34 g cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm sau chiết phân đoạn thu được 19,19 g cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm. Nghĩa là, 1 g cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm sau chiết phân đoạn thu được 0,0292 g cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm. Đây được quy ước là hệ số quy đổi liều từ cao toàn phần ethanol sang cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm.
2.1.3.Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng, giống đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, 7 – 8 tuần tuổi, khối lượng ban đầu 20 - 25 g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột được nuôi trong điều kiện phịng thí nghiệm (nhiệt độ: 25 ± 2oC, độ ẩm: 60-70%), cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn và uống nước tự do trong điều kiện sáng tối đảo ngược (pha sáng: 19 giờ - 7 giờ; pha tối: 7 giờ - 19 giờ).
2.1.4.Tế bào nghiên cứu
Tế bào NG108-15 (Neuroblastoma x glioma hybrid cell) lai giữa hai dòng tế bào riêng biệt bao gồm tế bào u nguyên bào thần kinh chuột cống N18TG2 và tế bào u thần kinh đệm chuột nhắt C6BU-1. Tế bào NG108-15 được Giáo sư Michihisa Tohda, Khoa Dược lý, Đại học Toyama, Nhật Bản tài trợ.