Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế
3.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic
Theo giả thuyết cholinergic, sự suy giảm nồng độ acetylcholin là một trong những nguyên nhân gây bệnh Alzheimer. Khi ức chế enzym AChE sẽ cản trở quá trình thủy phân acetylcholin. Từ đó làm bền vững và tăng nồng độ acetylcholin ở thần kinh trung ương nên có khả năng cải thiện trí nhớ. Vì vậy, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm di thực trong mô não chuột và in vitro.
3.2.1.1.Tác dụng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm di thực trong mô não chuột
Dựa trên thử nghiệm đánh giá tác dụng trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin và trimethyltin, cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực ở hai mức liều 600 và 1200 mg/kg cùng với cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm ở hai mức liều 17,5 và 35 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trong các test hành vi. Do đó, đề tài tiếp tục xác định đích tác dụng liên quan đến khả năng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm thông qua định lượng hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột.
73
- Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin
Trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin, sau khi kết thúc thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực thông qua các test hành vi, tiến hành tách mô não chuột và định lượng hoạt độ enzym AChE. Kết quả được trình bày trong hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột trên mơ hình scopolamin
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
### p<0,001 so với lơ chứng sinh lý; *** p<0,001 so với lô chứng bệnh
Kết quả hình 3.7 cho thấy, trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin, lơ chứng bệnh có hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột tăng 36,13% so với lô chứng sinh lý (p<0,001).
Các lơ thử cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm di thực ở hai mức liều 600 và 1200 mg/kg (EĐS1 và EĐS2) có hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột giảm 39,58 và 39,31% so với lô chứng bệnh (p<0,001).
Các lô thử cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ở hai mức liều 17,5 và 35 mg/kg (HĐS1 và HĐS2) cũng có hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột giảm
74
29,08 và 34,33% so với lô chứng bệnh (p<0,001). Tác dụng tương tự cũng được ghi nhận ở lô chứng dương dùng donepezil liều 5 mg/kg (p<0,001).
Khi so sánh giữa các lô thử, hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột của lô thử cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm ở mức liều 600 mg/kg (EĐS1) thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm ở mức liều 17,5 mg/kg (HĐS1) (p<0,05).
- Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin
Trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg, sau khi kết thúc thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực thông qua các test hành vi, tiến hành tách mô não chuột và định lượng hoạt độ enzym AChE. Kết quả trình bày trong hình 3.8.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột trên mơ hình trimethyltin
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
## p<0,01 so với lô chứng sinh lý; *p<0,05 so với lô chứng bệnh
Kết quả hình 3.8 cho thấy, lơ chứng bệnh có hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột tăng 23,62% so với lô chứng sinh lý (p<0,01).
Các lơ thử cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm di thực ở mức liều 1200 mg/kg (EĐS2) và cao phân đoạn n-hexan ở mức liều 35 mg/kg (HĐS2) có hoạt độ enzym AChE giảm 12,01 và 16,92% so với lơ chứng bệnh (p<0,05).
75
Trong khi đó, các lơ thử liều thấp là cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm liều 600 mg/kg (EĐS1) và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm liều 17,5 mg/kg (HĐS1) làm hoạt độ enzym AChE giảm khơng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p>0,05). Lô chứng dương dùng donepezil liều 5 mg/kg làm hoạt độ enzym AChE giảm 12,99% so với lô chứng bệnh (p<0,05).
3.2.1.2.Tác dụng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm di thực in vitro
Dựa trên kết quả định lượng hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột, cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực đều có khả năng ức chế enzym AChE. Để nghiên cứu sâu hơn về đích tác dụng này, đề tài lựa chọn cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm để tiếp tục đánh giá khả năng ức chế enzym AChE
in vitro, đồng thời xác định IC50 về khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE và đặc điểm động học ức chế enzym AChE.
- Tỷ lệ ức chế hoạt độ enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
Tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực (nồng độ 10, 25, 50, 100, 250 và 500 µg/mL) và chất đối chiếu donepezil (nồng độ 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 và 5,0 µg/mL) được đánh giá thơng qua tỷ lệ ức chế hoạt độ enzym AChE in vitro. Kết quả được trình bày trong hình 3.9.
Hình 3.9. Tỷ lệ ức chế hoạt độ enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và donepezil in vitro
76
Kết quả hình 3.9 cho thấy, trong khoảng nồng độ 10 – 500 µg/ml, cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có khả năng ức chế enzym AChE in vitro phụ thuộc nồng độ. Tại nồng độ thấp nhất 10 µg/ml, tỷ lệ ức chế hoạt độ enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm chỉ đạt 35,95%. Tại nồng độ cao nhất 500 µg/ml, giá trị này đạt 91,72%.
- IC50 của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE in vitro
Ảnh hưởng của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm đến IC50 vềkhả năng ức chế hoạt độ enzym AChE in vitro được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế 50% hoạt độ enzym AChE in vitro
Mẫu thử IC50 (µg/ml)
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực 24,12 ± 1,06 Chất đối chiếu donepezil 0,35 ± 0,10
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
Kết quả bảng 3.6 cho thấy cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE in vitro với IC50 đạt24,12 µg/ml và cao hơn so với donepezil. Qua đó cho thấy khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực yếu hơn donepezil.
Từ giá trị IC50, đề tài lựa chọn ba nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực là 10, 20 và 30 µg/ml cho thử nghiệm xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE in vitro.
3.2.1.3.Đặc điểm động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
- Kiểu động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
77
Kiểu động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro được xác định thông qua đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị mối tương quan giữa các nồng độ cơ chất ATCI và biến thiên mật độ quang theo thời gian. Kết quả được trình bày trong hình 3.10.
Hình 3.10. Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ATCI của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực
Kết quả hình 3.10 cho thấy đường biểu diễn của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ở ba nồng độ 10, 20 và 30 µg/ml có độ dốc lớn hơn đường biểu diễn của mẫu chứng. Sự có mặt của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực làm Km và vmax đều giảm. Đây là biểu hiện của kiểu ức chế không cạnh tranh hỗn hợp.
- Hằng số ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực Hằng số ức chế enzym AChE được xác định thông qua đồ thị Dixon biểu thị mối tương quan giữa các nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và vận tốc phản ứng khi thay đổi nồng độ cơ chất ATCI. Kết quả được trình bày trong hình 3.11.
78
Hình 3.11. Đồ thị Dixon biểu thị mối tương quan giữa các nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và vận tốc phản ứng
Kết quả hình 3.11 cho thấy, hằng số ức chế enzym AChE (Ki) của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực là giao điểm của ba đường biểu diễn tương ứng với ba nồng độ cơ chất ATCI khác nhau (0,0625; 0,125 và 0,25 mM). Dựa vào phương trình đường thẳng của mỗi nồng độ cơ chất ATCI, xác định được Ki của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có giá trị 30,91 ± 1,0 μg/ml.