Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế
3.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid
Theo giả thuyết β-amyloid, sự tích lũy của các mảng β-amyloid là một trong những nguyên nhân gây bệnh Alzheimer. Do đó, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid góp phần cải thiện tiến triển của bệnh Alzheimer. Vì vậy đề tài tiến hành đánh giá bảo vệ tế bào thần kinh NG108-15 khỏi độc tính do β-amyloid25- 35 gây ra của cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực. Thử nghiệm này gồm có hai giai đoạn, đầu tiên xác định độc tính trên tế bào NG108-15; sau đó chọn ra các nồng độ có tỷ lệ tế bào sống sót trên 90% để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao rễ Đan sâm di thực.
3.2.2.1.Độc tính của cao rễ Đan sâm di thực trên tế bào NG108-15
Độc tính của cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực trên tế bào thần kinh NG108-15 được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào sống sót
79
sau khi được ủ với cao rễ Đan sâm ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày trong hình 3.12.
Hình 3.12. Độc tính của cao rễ Đan sâm di thực trên tế bào NG108-15
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
Kết quả hình 3.12 cho thấy: Sau khi ủ tế bào NG108-15 với cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực ở các nồng độ khác nhau, nồng độ 0,5 μg/ml không gây chết tế bào; hai nồng độ 1,0 và 2,0 μg/ml ít gây chết tế bào với tỷ lệ tế bào sống sót là 98,0 và 91,3%. Do đó, ba nồng độ này của cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực được lựa chọn cho thử nghiệm xác định tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid25-35.
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ở cùng nồng độ với cao toàn phần ethanol có tỷ lệ tế bào sống sót thấp hơn. Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực tại nồng độ thấp nhất 0,25 μg/ml không gây chết tế bào; hai nồng độ 0,5 và 1,0 μg/ml ít gây chết tế bào với tỷ lệ tế bào sống sót là 99,4 và 94,4%. Do đó, ba nồng độ này của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực được lựa chọn để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh NG108-15 khỏi độc tính của β-amyloid25-35.
80
3.2.2.2.Tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính gây ra bởi β-amyloid25-35
của cao rễ Đan sâm di thực
Tác dụng bảo vệ tế bào khỏi độc tính gây ra bởi β-amyloid25-35 của cao rễ Đan sâm di thực được đánh giá thơng qua tỷ lệ tế bào sống sót sau khi gây độc tế bào NG108-15 bằng β-amyloid25-35 tại nồng độ 20 μM. Kết quả được trình bày trong hình 3.13.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến tỷ lệ tế bào NG108-15 sống sót sau khi bị gây độc bằng β-amyloid25-35
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
### p<0,001 so với mẫu chứng; ** p<0,01 và *** p<0,001 so với mẫu chứng bệnh
Kết quả hình 3.13 cho thấy mẫu chứng bệnh có tỷ lệ tế bào sống sót giảm có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng (p<0,001).
Mẫu thử cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực tại nồng độ 2,0 μg/ml làm tỷ lệ tế bào sống sót tăng 38,09% so với mẫu chứng bệnh (p<0,01). Trong khi đó, các mẫu thử nồng độ thấp của cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực là 0,5 và 1,0 μg/ml không làm tỷ lệ tế bào sống sót tăng khác biệt so với mẫu chứng bệnh (p>0,05).
81
Các mẫu thử của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ở nồng độ 0,25; 0,5 và 1,0 μg/ml làm tỷ lệ tế bào sống sót tăng 43,44; 46,46 và 56,26% so với mẫu chứng bệnh (p<0,01 và p<0,001).
3.2.3.Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
Theo giả thuyết stress oxy hóa, sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và các chất chống oxy hóa dẫn đến sản xuất quá mức các gốc tự do có thể gây rối loạn một số quá trình trong cơ thể như thúc đẩy quá trình peroxid hóa lipid. Đây được coi là một trong những nguyên nhân gây bệnh Alzheimer. Do đó, chống stress oxy hóa góp phần làm chậm tiến triển của bệnh Alzheimer. Vì vậy, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực thơng qua xác định khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid và dọn gốc tự do DPPH và superoxid in vitro.
3.2.3.1.Tác dụng ức chế q trình peroxid hóa lipid trong mơ não chuột của cao rễ Đan sâm di thực
Dựa trên thử nghiệm đánh giá tác dụng trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 và trimethyltin, cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm di thực ở hai mức liều 600 và 1200 mg/kg cùng với cao phân đoạn n-hexan ở hai mức liều 17,5 và 35 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trong các test hành vi. Do đó, đề tài tiếp tục xác định tác dụng liên quan đến khả năng chống stress oxy hóa của cao rễ Đan sâm, cụ thể là khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid thông qua định lượng hàm lượng MDA trong mô não chuột.
- Ức chế hàm lượng MDA trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng β- amyloid25-35 của cao rễ Đan sâm di thực
Trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng tiêm β-amyloid25-35 vào não thất mức liều 9 nmol, sau thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực thông qua các test hành vi, tiến hành tách mô não chuột và định lượng hàm lượng MDA. Kết quả được trình bày trong hình 3.14.
82
Hình 3.14. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hàm lượng MDA trong mơ não chuột trên mơ hình β-amyloid25-35
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
### p<0,001 so với lô chứng sinh lý; *** p<0,001 so với lơ bệnh
Kết quả hình 3.14 cho thấy, trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng β- amyloid25-35, lô chứng bệnh có hàm lượng MDA trong mô não chuột tăng 96,08% so với lô chứng sinh lý (p<0,001).
Các lơ thử cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm ở hai mức liều 600 và 1200 mg/kg (EĐS1 và EĐS2) có hàm lượng MDA giảm 22,35 và 18,50% so với lô chứng bệnh (p<0,001).
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm ở hai mức liều 17,5 và 35 mg/kg (HĐS1 và HĐS2) đều làm hàm lượng MDA giảm 27,09 và 13,92% so với lô chứng bệnh (p<0,001). Tác dụng này cũng được ghi nhận đối với lô chứng dương dùng donepezil liều 5 mg/kg (p<0,001).
- Ức chế hàm lượng MDA trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin của cao rễ Đan sâm di thực
Trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg, sau khi kết thúc thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao toàn phần ethanol và
83
cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm thông qua các test hành vi, tiến hành tách mô não chuột và định lượng hàm lượng MDA. Kết quả được trình bày trong hình 3.15.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hàm lượng MDA trong mơ não chuột trên mơ hình trimethyltin
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
#p<0,05 so với lô chứng sinh lý; *p<0,05; **p<0,01 so với lô bệnh
Kết quả hình 3.15 cho thấy, trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin, lơ chứng bệnh có hàm lượng MDA trong mơ não chuột tăng 32,46% so với lô chứng sinh lý (p<0,05).
Các lơ thử cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm ở mức liều 1200 mg/kg (EĐS2) và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm ở mức liều 35 mg/kg (HĐS2) có hàm lượng MDA giảm 25,54% (p<0,05) và 29,33% (p<0,01) so với lơ chứng bệnh.
Trong khi đó, các lơ thử liều thấp là cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm liều 600 mg/kg (EĐS1) và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm liều 17,5 mg/kg (HĐS1) làm hàm lượng MDA giảm khơng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p>0,05).
Lô chứng dương dùng donepezil liều 5 mg/kg có hàm lượng MDA giảm 34,0% so với lô chứng bệnh (p<0,01).
84
3.2.3.2.Tác dụng dọn gốc tự do của cao rễ Đan sâm di thực in vitro
Dựa trên kết quả định lượng hàm lượng MDA trong mơ não chuột, cao tồn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực đều có khả năng chống stress oxy hóa thơng qua ức chế q trình peroxid hóa lipid. Để có cái nhìn rõ hơn về tác dụng này, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid in vitro của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm.
- Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-hexanrễ Đan sâm di thực in vitro
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro được đánh giá thông qua tỷ lệ dọn gốc tự do DPPH được trình bày trong hình 3.16 và khảo sát IC50 ở 6 nồng độ thử (10, 25, 50, 75, 100 và 250 µg/ml) được trình bày trong bảng 3.7. Trong thử nghiệm này sử dụng quercetin là chất đối chiếu.
Hình 3.16. Tỷ lệ dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
Kết quả hình 3.16 cho thấy trong khoảng nồng độ 10 – 250 µg/ml, cao phân đoạn n- hexan rễ Đan sâm di thực có khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro phụ thuộc nồng độ. Tại nồng độ 75 μg/ml, tỷ lệ dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực chỉ đạt 38,62%; ở nồng độ cao nhất 250 μg/ml có tỷ lệ dọn gốc tự do DPPH lớn nhất đạt 86,20%.
85
Bảng 3.7. Nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin có tác dụng dọn 50% gốc tự do DPPH in vitro
Mẫu thử IC50 (μg/ml)
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực 95,57 ± 2,06 Chất đối chiếu quercetin 15,25 ± 1,54
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
Kết quả bảng 3.7 cho thấy cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có khả năng dọn gốc tự do DPPH với IC50 đạt 95,57 µg/ml và cao hơn so với chất đối chiếu quercetin. Qua đó cho thấy khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực yếu hơn quercetin.
- Tác dụng dọn gốc tự do superoxid của cao phân đoạn n-hexanrễ Đan sâm di thực in vitro
Tác dụng dọn gốc tự do superoxid của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro được đánh giá qua tỷ lệ dọn gốc tự do superoxid được trình bày trong hình 3.17 và khảo sát IC50 ở 5 nồng độ thử (6,25; 12,5; 25; 50 và 100 µg/ml) được trình bày trong bảng 3.8. Trong thử nghiệm này sử dụng quercetin là chất đối chiếu.
Hình 3.17. Tỷ lệ dọn gốc tự do superoxid của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin in vitro
86
Kết quả hình 3.17 cho thấy trong khoảng nồng độ 6,25 – 100 µg/ml, cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có khả năng dọn gốc tự do superoxid in vitro
phụ thuộc nồng độ. Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ở nồng độ 50 μg/ml có tỷ lệ dọn gốc tự do superoxid là 58,37%; ở nồng độ cao nhất là 100 μg/ml có tỷ lệ dọn gốc tự do superoxid lớn nhất đạt 79,30%.
Bảng 3.8. Nồng độ của của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin có tác dụng dọn 50% gốc tự do superoxid in vitro
Mẫu thử IC50 (μg/ml)
Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực 31,09 ± 1,05 Chất đối chiếu quercetin 5,48 ± 1,07
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD
Kết quả bảng 3.8 cho thấy cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có tác dụng dọn gốc tự do superoxid với IC50 đạt 31,09 µg/ml và cao hơn so với chất đối chiếu quercetin. Qua đó cho thấy khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực yếu hơn quercetin.
87