2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích
đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
Sau thử nghiệm đánh giá tác dụng thông qua test hành vi, đề tài tiếp tục đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm liên quan đến ba giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer bao gồm giả thuyết cholinergic, β-amyloid và stress oxy hóa.
2.5.2.1.Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên đích liên quan đến giả thuyết cholinergic
Dựa trên giả thuyết cholinergic về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, đề tài lựa chọn đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm thơng qua đích ức chế enzym AChE. Đây là một trong những đích tác dụng quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer [86]. Theo đó, nghiên cứu tiến hành đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm trong mô não chuột và in vitro.
Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của cao rễ Đan sâm di thực trong mô não chuột
Sau thử nghiệm đánh giá tác dụng trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin và trimethyltin thông qua các test hành vi, đề tài tiếp tục xác định khả năng ức chế enzym AChE thông qua định lượng hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột của cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực liều 600 và 1200 mg/kg cùng với cao phân đoạn n-hexan liều 17,5 và 35 mg/kg.
- Thiết kế thí nghiệm
Tiến hành đánh giá khả năng ức chế enzym AChE trong mô não chuột theo nghiên cứu của Ellman G. L. và cộng sự [56].
Vào ngày thứ 22 trong thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mơ hình scopolamin đã trình bày trong mục 2.5.1.1 và ngày thứ 23 trên mơ hình trimethyltin đã trình bày trong mục 2.5.1.3, tiến hành tách lấy phần mô não chuột rửa nhanh qua nước muối sinh lý lạnh, nghiền đồng thể trong điều kiện lạnh thu được dịch nghiền đồng thể để định lượng hoạt độ enzym AChE với quy trình được trình bày trong phụ lục 10.
- Thơng số đánh giá
Thông số đánh giá là hoạt độ enzym AChE trong mơ não chuột. Trong đó, một đơn vị hoạt độ AChE là lượng enzym xúc tác hình thành 1 µmol thiocholin mỗi phút ở 25oC.
Mẫu thử được coi là có khả năng ức chế enzym AChE khi hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột ở lô thử nhỏ hơn so với lơ chứng bệnh có ý nghĩa thống kê.
51
Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
Để nghiên cứu sâu hơn về đích tác dụng này, đề tài lựa chọn cao phân đoạn
n-hexan rễ Đan sâm di thực để tiếp tục đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro và xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE in vitro.
- Thiết kế thí nghiệm
Tiến hành theo nghiên cứu của Mathew M. và cộng sự [141], gồm 3 mẫu: + Mẫu chứng gồm đệm phosphat 100mM pH =7,5; enzym AChE nồng độ 0,025 UI; thuốc thử DTNB, cơ chất ATCI đều có nồng độ 0,125 mM và DMSO có nồng độ tương tự như trong mẫu thử.
+ Mẫu donepezil gồm các thành phần giống mẫu chứng và bổ sung thêm donepezil với các nồng độ 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 và 5,0 µg/mL.
+ Mẫu thử HĐS gồm các thành phần giống mẫu trắng và bổ sung thêm dung dịch cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm được hòa trong DMSO rồi pha loãng bằng đệm để thu được nồng độ cuối là 10, 25, 50, 100, 250 và 500 µg/mL.
Chi tiết thành phần trong mỗi mẫu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần trong mỗi mẫu để xác định khả năng ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
STT Thành phần Mẫu chứng (µl) Mẫu donepezil (µl) Mẫu thử HĐS (µl) 1 Đệm phosphat 140 120 120 2 Mẫu HĐS 0 0 20 3 Donepezil 0 20 0 4 Enzym AChE 0,025 U 20 20 20 5 DTNB 0,125 mM 20 20 20 6 ATCI 0,125 mM 20 20 20 Tổng thể tích (µl)200 200 200
Thử nghiệm thực hiện bằng cách cho donepezil hoặc cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm phản ứng với enzym AChE trong đệm phosphat rồi trộn đều và ủ 15 phút ở 25oC. Sau đó bổ sung cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB, lắc đều rồi đo hỗn hợp sau phản ứng tại bước sóng 412 nm, tần suất 2 phút/lần trong 10 phút ở 25oC.
- Thông số đánh giá
52
Tỷ lệ ức chế (%) = ∆ODchứng/phút- ∆ODdonepezil/HĐS/phút
∆ODchứng/phút x 100
Trong đó ΔODchứng/phút là thay đổi mật độ quang mỗi phút của mẫu chứng;
ΔODdonepezil/HĐS/phút là thay đổi mật độ quang mỗi phút của mẫu donepezil hoặc cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm.
+ IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzym AChE được xác định bằng phần mềm GraphPad Prism 7.0
Từ giá trị IC50 của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm, lựa chọn ba nồng độ cho thử nghiệm xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE in vitro.
Xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n- hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
- Thiết kế thí nghiệm
Tiến hành theo nghiên cứu của Wong K. K. [227], gồm ba mẫu:
+ Mẫu chứng gồm đệm phosphat 100mM, pH = 7,5; enzym AChE nồng độ 0,025 UI; thuốc thử DTNB nồng độ 0,125 mM và cơ chất ATCI bao gồm 3 nồng độ 0,0625; 0,125 và 0,25 mM.
+ Mẫu thử HĐS gồm các thành phần giống mẫu chứng, nhưng bổ sung thêm dung dịch cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực với ba nồng độ được lựa chọn từ thử nghiệm xác định khả năng ức chế enzym AChE in vitro.
Chi tiết thành phần trong mỗi mẫu được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần trong mỗi mẫu để xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro
STT Thành phần Mẫu chứng (µl) Mẫu thử HĐS (µl) 1 Đệm phosphat 140 120 2 Mẫu HĐS 0 20 3 Enzym AChE 0,025 U 20 20 4 DTNB 0,125 mM 20 20 5 ATCI 0,0625; 0,125 và 0,25 mM 20 20 Tổng thể tích (µl)200 200
Phản ứng được thực hiện bằng cách cho cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực phản ứng với enzym AChE trong môi trường đệm phosphat rồi trộn đều và ủ 15 phút ở 25oC. Sau đó bổ sung cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB, lắc đều rồi đo hỗn hợp sau phản ứng tại bước sóng 412 nm, tần suất 2 phút/lần trong 10 phút ở
53
25oC. Từ đó xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị mối tương quan giữa (1/[ATCI]) và (1/v) cùng với đồ thị Dixon biểu thị mối tương quan giữa (nồng độ cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm) và (1/v).
- Thông số đánh giá
+ Kiểu động học ức chế enzym AChE được xác định từ đồ thị Lineweaver- Burk. Dựa vào hằng số Michalis Menten (Km) và tốc độ cực đại (vmax) khi có mặt chất ức chế để xác định động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm có thể theo một trong những kiểu sau:
Ức chế cạnh tranh: Độ dốc của đường thẳng có chất ức chế enzym AChE lớn hơn đường thẳng khơng có chất ức chế; Km tăng, vmax khơng đổi khi có chất ức chế.
Ức chế cạnh tranh khơng hồn tồn: Độ dốc của đường thẳng có hoặc khơng có chất ức chế enzym AChE như nhau; Km, vmax đều giảm khi có chất ức chế.
Ức chế khơng cạnh tranh đơn thuần: Độ dốc của đường thẳng có chất ức chế enzym AChE lớn hơn đường thẳng khơng có chất ức chế; Km không đổi và vmax giảm khi có chất ức chế.
Ức chế khơng cạnh tranh hỗn hợp: Độ dốc của đường thẳng có chất ức chế enzym AChE lớn hơn đường thẳng khơng có chất ức chế; Km tăng hoặc giảm và vmax giảm khi có chất ức chế.
+ Hằng số ức chế enzym AChE (Ki) là nồng độ cần thiết của cao phân đoạn
n-hexan rễ Đan sâm để ức chế 50% hoạt độ enzym AChE. Ki là giao điểm của các đường biểu diễn tương ứng với ba nồng độ cơ chất ATCI trong đồ thị Dixon.
2.5.2.2.Phương pháp đánh giá tác dụng liên quan đến giả thuyết β-amyloid
Dựa trên cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, các đích liên quan đến giả thuyết β-amyloid như giảm sản xuất, giảm kết tập và tăng thải trừ β-amyloid đều hướng tới mục tiêu làm giảm độc tính do β-amyloid gây ra [25], [140]. Do đó, chúng tơi tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính do β- amyloid25-35 của cao rễ Đan sâm. Thử nghiệm gồm hai giai đoạn, đầu tiên đánh giá độc tính của cao rễ Đan sâm trên tế bào NG108-15; sau đó chọn ra các nồng độ ít gây chết tế bào để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao rễ Đan sâm.
Đánh giá độc tính của cao rễ Đan sâm di thực trên tế bào NG108-15
Tiến hành theo nghiên cứu của Yu H. và cộng sự có cải tiến [236]. Tế bào NG108-15 được nuôi cấy trong mơi trường DMEM có bổ sung thêm 4% huyết thanh bào thai bị, hypoxanthin 100 µM, thymidin 16 µM, aminopterin 1 µM và minomycin 1 µg/ml ở nhiệt độ 37oC, khơng khí chứa 5% CO2.
54 - Thiết kế thí nghiệm
Tế bào trong mỗi đĩa 96 giếng có mật độ là 8 x 103 tế bào/giếng, gồm 3 mẫu, mỗi mẫu 9 giếng:
+ Mẫu chứng gồm 95 μl dung dịch tế bào NG108-15 và 5 μl môi trường DMEM
+ Mẫu thử EĐS có thành phần tương tự mẫu chứng nhưng bổ sung 5 μl dung dịch cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm được hịa trong DMSO rồi pha lỗng bằng môi trường để thu được nồng độ cuối là 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml.
+ Mẫu thử HĐS có thành phần tương tự mẫu chứng nhưng bổ sung 5 μl dung dịch cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm được hịa trong DMSO rồi pha lỗng bằng môi trường để thu được nồng độ cuối là 0,25; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml.
Sau khi chia tế bào ra đĩa 24 giờ, 5 µl mơi trường DMEM, cao toàn phần ethanol hoặc cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm với các nồng độ khác nhau được tra vào mỗi giếng và ni cấy trong 48 giờ. Tiếp đó bổ sung 10 µl MTT nồng độ 5 mg/ml vào mỗi giếng và ủ trong 3 giờ. Sau khi loại bỏ mơi trường ni cấy thì bổ sung 100 µl DMSO vào mỗi giếng để đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
- Thơng số đánh giá
Tỷ lệ tế bào sống sót là tỷ lệ phần trăm số lượng tế bào sống sót của mẫu cao rễ Đan sâm so với mẫu chứng. Số lượng tế bào sống sót tỷ lệ với độ hấp thụ của mỗi mẫu, được tính theo cơng thức:
Tỷ lệ tế bào sống sót (%) =AEĐS/HĐS
AChứng x 100
Trong đó: AEĐS/HĐS là độ hấp thụ của mẫu cao toàn phần ethanol hoặc cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm, AChứng là độ hấp thụ của mẫu chứng.
Thơng qua tỷ lệ tế bào sống sót khi được ủ với cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan, lựa chọn ba nồng độ cho mỗi loại cao có tỷ lệ tế bào sống sót trên 90% để áp dụng cho thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính của β-amyloid25-35.
Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính do β-amyloid25-35 gây ra của cao rễ Đan sâm di thực
- Thiết kế thí nghiệm
Tiến hành theo nghiên cứu của Shi L. L. và cộng sự có cải tiến [193]. Thử nghiệm thực hiện trên đĩa 96 giếng, gồm bốn mẫu:
55
+ Mẫu chứng (n=10) gồm dung dịch tế bào NG108-15 và môi trường nuôi cấy DMEM.
+ Mẫu chứng bệnh (n=10) có thành phần tương tự mẫu chứng nhưng bổ sung thêm β-amyloid25-35 nồng độ 20 mM.
+ Mẫu thử EĐS (n=6) có thành phần tương tự mẫu chứng bệnhnhưng bổ sung thêm dung dịch cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm với các nồng độ được xác định từ thử nghiệm xác định độc tính.
+ Mẫu thử HĐS (n=6) có thành phần tương tự mẫu chứng bệnhnhưng bổ sung thêm dung dịch cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm với các nồng độ được xác định từ thử nghiệm xác định độc tính.
Chi tiết thành phần phản ứng của mỗi mẫu được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần trong các mẫu để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính gây ra bởi β-amyloid25-35 của cao rễ Đan sâm di thực
TT Thành phần trong giếng Mẫu chứng (µl) Mẫu chứng bệnh (µl) Mẫu thử EĐS/HĐS (µl)
1 Mơi trường DMEM 10 5 0
2 NG108-15 90 90 90
3 Mẫu EĐS/HĐS 0 0 5
4 β-amyloid25-35 20 mM 0 5 5
Tổng thể tích (µl)100 100 100
Sau khi chia ra đĩa 96 giếng được 24 giờ, tế bào trong các mẫu thử được ủ với 5 µl dung dịch cao tồn phần ethanol hoặc cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm (ủ môi trường DMEM với mẫu chứng và mẫu chứng bệnh). Sau 2 giờ, tế bào trong các mẫu bị gây độc bằng 5 µl dung dịch β-amyloid25-35 nồng độ 20 mM (riêng mẫu chứng được tra 5 µl mơi trường DMEM) và ni cấy trong 48 giờ. Tiếp đó bổ sung 10 µl MTT nồng độ 5 mg/ml vào mỗi giếng và ủ trong 3 giờ. Sau khi loại bỏ mơi trường thì cho 100 µl DMSO vào mỗi giếng để đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
- Thông số đánh giá
Tỷ lệ tế bào sống sót là tỷ lệ phần trăm số lượng tế bào sống sót của mẫu cao rễ Đan sâm hoặc mẫu chứng bệnh so với mẫu chứng. Số lượng tế bào sống sót tỷ lệ với độ hấp thụ của mỗi mẫu, được tính theo cơng thức:
Tỷ lệ tế bào sống sót (%) = AChứng bệnh/EĐS/HĐS
56
Trong đó: Achứng bệnh/EĐS/HĐS là độ hấp thụ của mẫu chứng bệnh, cao toàn phần ethanol hoặc phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm, AChứng là độ hấp thụ của mẫu chứng.
Mẫu thử được coi là có tác dụng bảo vệ tế bào NG108 khỏi độc tính của β- amyloid25-35 khi tỷ lệ tế bào sống sót của mẫu thử cao hơn mẫu chứng bệnh có ý nghĩa thống kê.
2.5.2.3.Phương pháp đánh giá tác dụng liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa của cao rễ Đan sâm di thực
Dựa trên giả thuyết stress oxy hóa về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, sự hình thành các gốc tự do và tăng cường peroxid hóa lipid là những yếu tố thúc đẩy q trình stress oxy hóa dẫn đến tổn thương, thối hóa, teo và chết tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer [107], [210]. Do đó, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm thông qua xác định khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid trong mô não chuột và khả năng dọn gốc tự do DPPH và superoxid in vitro.
Tác dụng ức chế peroxid hóa lipid trong mơ não chuột của cao rễ Đan sâm di thực
- Nguyên tắc của phương pháp
Khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid được đánh giá thông qua định lượng hàm lượng MDA trong mơ não chuột. Q trình được tiến hành theo phương pháp của Wasowicz W. [222].
Sau thử nghiệm đánh giá tác dụng trên mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng β- amyloid25-35 và trimethyltin thơng qua các test hành vi, đề tài tiến hành xác định khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid của cao tồn phần ethanol rễ Đan sâm liều 600 và 1200 mg/kg cùng với cao phân đoạn n-hexan liều 17,5 và 35 mg/kg.
- Thiết kế thí nghiệm
Vào ngày thứ 28 trong thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mơ hình β-amyloid25-35 đã trình bày trong mục 2.5.1.2 và ngày thứ 23 trên mơ hình trimethyltin đã trình bày trong mục 2.5.1.3, tiến hành tách mô não chuột để định lượng hàm lượng MDA với quy trình được trình bày chi tiết trong phụ lục 12.