Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Be- 123docz.net

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu

3.1.1. Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1

3.1.1.1. Thử nghiệm nhận dạng trên ngân hàng chủng gốc và chủng sản xuất

Bảng 3.1. Kết quả nhận dạng của chủng gốc và chủng sản xuất bằng phương pháp

ELISA

Độ pha lỗng

Kết quả OD trung bình Blank/chứng âm Mẫu chuẩn

BR209 BV-MSV-0210 BV-WSV-0310 10 0,008 0,65 1,62 1,64 40 0,007 0,205 0,961 1,02 160 0,007 0,073 0,52 0,44 640 0,008 0,042 0,14 0,18 Kết quả nhận dạng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV- 0310) bằng phương pháp ELISA cho thấy, ở nồng độ pha loãng 640 lần, OD của chủng gốc cao hơn khoảng 17,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm và chủng sản xuất cao hơn khoảng 22,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm. Kết quả này chứng tỏ rằng chủng gốc và chủng sản xuất có hàm lượng kháng nguyên rất cao. Tại độ pha loãng 10 lần, chủng gốc và chủng sản xuất đều có hàm lượng kháng nguyên cao hơn mẫu chuẩn gấp khoảng 2,5 lần (bảng 3.1).

Kết quả giải trình tự gen của vi rút của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) cho thấy trình tự nucleotide và trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của 2 chủng này có sự tương đồng 100% và so với chủng chuẩn tham chiếu Reference JEV Beijing-Kanonji cũng tương đồng 100% (Hình 3.1).

Hình 3. 1. Kết quả giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự

nucleotide (A) và axít amin (B) của chủng gốc và chủng sản xuất với chủng Beijing chuẩn

3.1.1.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra LD50 trên não chuột Swiss của chủng gốc BV-MSV-

0210 Độ pha Số chuột thí nghiệm Số chuột sống Số chuột chết % chuột chết Hiệu giá chủng (LD50) 10-6 10 0 10 100 4,79.107 10-7 10 2 8 85,7 10-8 10 6 4 33,33

Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút trên não chuột của chủng gốc (BV-MSV- 0210), ở độ pha 10-6 chuột chết 100%, độ pha 10-7 tỷ lệ chết 85,7% (>50%), độ pha 10-8 tỷ lệ chết 33,33 %(<50%). LD50 của chủng xác định là 4,79.107. Hiệu giá của chủng gốc được xác định là > 107/ml, đạt tiêu chuẩn dự kiến là ≥ 107/ml (bảng 3.2).

Bảng 3. 3. Kết quả kiểm tra LD50trên não chuột Swiss của chủng sản xuất BV-

WSV-0310 Độ pha Số chuột thí nghiệm Số chuột sống Số chuột chết % chuột chết Hiệu giá chủng (LD50) 10-6 10 0 10 100 2,24.107 10-7 10 3 7 72,7 10-8 10 9 1 7,7

Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút trên não chuột của chủng sản xuất(BV-WSV- 0310) cho thấy, ở độ pha 10-6 chuột chết 100%, độ pha 10-7 tỷ lệ chết 72,7% (>50%), độ pha 10-8 tỷ lệ chết 7,7 %(<50%). LD50 của chủng xác định là 2,24.107. Hiệu giá của chủng sản xuất được xác định là > 107/ml, đạt tiêu chuẩn dự kiến là ≥ 107/ml (bảng 3.3).

Hiệu giá chủng vi rút sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản BV-WSV-0310 được thực hiện bằng phương pháp tạo đám hoại tử PFU/ml trên tế bào sau 5 ngày gây nhiễm được mơ tả tại hình 3.2.

Hình 3.2. Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV-

0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo đám

hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21

Độ pha loãng

Số plaque Hiệu giá (PFU/ml)

Hiệu giá trung bình (PFU/ml) Số plaque Trung bình 10-5 100; 137 118,5 5,92.107 8,72.107 (hay 7,94 log) 10-6 22; 19 20,5 10,25.107 10-7 1; 3 2,0 10,00.107 10-8 0;0 0 0

Bằng phương pháp thử nghiệm trên tế bào, hiệu giá trung bình của chủng gốc BV-MSV-0210 là 8,72x107 PFU/ml (bảng 3.4).

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 bằng thử nghiệm tạo

đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21

Độ pha loãng Số plaque Hiệu giá (PFU/ml)

Hiệu giá trung bình (PFU/ml) Số plaque Trung bình 10-5 91;84 87,5 4,37. 107 3,93. 107 (hay 7,59 log) 10-6 6;8 7 3,50.107 10-7 0;0 0 0

Bằng phương pháp thử nghiệm trên tế bào, hiệu giá trung bình của chủng sản xuất BV-WSV-0310 là 3,93x107 PFU/ml (bảng 3.5).

Trước Vabiotech chỉ sử dụng tế bào BHK-21, trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng thêm cả tế bào Vero là dòng tế bào sử dụng để sản xuất vắc xin để thẩm định sự phù hợp và cần thiết có thể thay thế tế bào BHK-21 cho tiện sử dụng kiểm định sau này.

10-6 10-7

Thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21

Thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào Vero

Hình 3. 3.Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV-

0310 trên dòng tế bào BHK21 và dòng tế bào Vero.

Kết quả hình Plaque ở tế bào BHK21 tạo ra to hơn tế bào Vero nhưng số lượng (kết quả) như nhau và đều dễ đọc bằng mắt thường (hình 3.3).

3.1.1.3. Tính ổn định về di truyền của chủng theo thời gian cất giữ

a. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc, chủng sản xuất và chủng tham chiếu

Hình 3. 4. Điện di gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm RT-PCR khuếch đại gen mã

hóa kháng nguyên E của các chủng: chủng gốc BV-MSV-0210 (đường chạy số 1); chủng sản xuất BV-WSV-0310 (đường chạy số 2); chủng chuẩn tham chiếu JEV

Beijing-1 Kanonji (đường chạy số 3). M: Farmentas 1 kb DNA ladder.

M 1 2 3

1500 bp- 1000 bp-

Gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310 so với chủng chuẩn tham chiếu JEV Beijing-Kanonji do Nhật Bản cung cấp đã được khuếch đại bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR rất đặc hiệu, khơng có sản phẩm phụ, kích thước tương đương với độ dài của gen E theo tính tốn lý thuyết (khoảng 1500 bp). Kết quả được nêu ở hình 3.4.

b. Kết quả giải trình tự và phân tích gen E của các chủng gốc và chủng sản xuất

Hình 3. 5. Trình tự acid amin kháng nguyên E của vi rút VNNB lô chủng giống gốc

BV-MSV-0210 (A) và sản xuất BV-WSV-0310 (B) ID BV-MSV-0210_P PRELIMINARY; PRT; 500 AA.

SQ SEQUENCE 500 AA; 53562 MW; 1331854 CN;

FNCLGMGNRD FIEGASGATW VDLVLEGDSC LTIMANDKPT LDVRMINIEA SQLAEVRSYC YHASVTDIST VARCPTTGEA HNEKRADSSY VCKQGFTDRG WGNGCGLFGK GSIDTCAKFS CTRKAIGRTI QPENIKYEVG IFVHGTTTSE NHGNYSAQVG ASQAAKFTVT PNAPSITLKL GDYGEVTLDC EPRSGLNTEA FYVMTVGSKS FLVHREWFHD LALPWTPPSS TAWRNRELLM EFEEAHATKQ SVVALGSQEG GLHQALAGAI VVEYSSSVKL TSGHLKCRLK MDKLALKGTT YGMCTEKFSF AKNPADTGHG TVVIELSYSG SDGPCKIPIV SVASLNDMTP VGRLVTVNPF VATSSANSKV LVEMEPPFGD SYIVVGRGDK QINHHWYKAG STLGKAFSTT LKGAQRLAAL GDTAWDFGSI GGVFNSIGKA VHQVFGGAFR TLFGGMSWIT QGLMGALLLW MGINARDRSI ALAFLATGGV LVFLATNVHA

ID BV-WSV-0310_P PRELIMINARY; PRT; 500 AA. SQ SEQUENCE 500 AA; 53562 MW; 1331854 CN;

Hình 3. 6. Trình tự nucleotide gen mã hóa kháng ngun E của vi rút VNNB lơ

chủng giống gốc BV-MSV-0210 (A) và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 (B)m ID BV-MSV-0210 PRELIMINARY; DNA; 1500 BP.

SQ SEQUENCE 1500 BP; 393 A; 362 C; 411 G; 334 T;

TTCAACTGTC TGGGAATGGG CAATCGTGAC TTCATAGAAG GAGCCAGTGG AGCCACTTGG GTGGACTTGG TGCTAGAAGG AGACAGCTGC TTGACAATCA TGGCAAACGA CAAACCAACA TTGGACGTCC GCATGATCAA CATCGAAGCT AGCCAACTTG CTGAGGTCAG AAGTTACTGC TATCATGCTT CAGTCACTGA CATCTCGACG GTGGCTCGGT GCCCCACGAC TGGAGAAGCC CACAACGAGA AGCGAGCTGA TAGTAGCTAT GTGTGCAAAC AAGGCTTCAC TGATCGTGGG TGGGGCAACG GATGTGGACT TTTCGGGAAG GGAAGTATTG ACACATGTGC AAAATTCTCC TGCACCAGGA AAGCGATTGG GAGAACAATC CAGCCAGAAA ACATCAAATA CGAAGTTGGC ATTTTTGTGC ATGGAACCAC CACTTCGGAA AACCATGGGA ATTATTCAGC GCAAGTTGGG GCGTCCCAGG CGGCAAAGTT TACAGTAACA CCTAATGCTC CTTCGATAAC CCTCAAACTT GGTGACTACG GAGAAGTCAC ACTGGACTGT GAGCCAAGGA GTGGACTAAA CACTGAAGCG TTTTACGTCA TGACCGTGGG GTCAAAGTCA TTTTTGGTCC ATAGGGAATG GTTTCATGAC CTCGCTCTCC CTTGGACGCC CCCTTCGAGC ACAGCGTGGA GAAACAGAGA ACTCCTCATG GAATTTGAAG AGGCGCACGC CACAAAACAG TCCGTTGTTG CTCTTGGGTC ACAGGAAGGA GGCCTCCATC AGGCGTTGGC AGGAGCCATC GTGGTGGAGT ACTCAAGCTC AGTGAAGTTA ACATCAGGCC ACCTAAAATG CAGGCTGAAA ATGGACAAAC TGGCTCTGAA AGGCACAACC TATGGTATGT GCACAGAAAA ATTCTCGTTC GCGAAAAATC CGGCGGACAC TGGTCACGGA ACAGTTGTCA TTGAACTTTC ATACTCTGGG AGTGATGGCC CCTGCAAGAT TCCGATTGTC TCCGTTGCTA GCCTCAATGA CATGACCCCC GTCGGGCGGC TGGTGACAGT GAACCCCTTC GTCGCGACTT CCAGCGCCAA CTCAAAGGTG CTGGTCGAGA TGGAACCCCC CTTCGGAGAC TCCTACATCG TAGTTGGAAG GGGAGACAAG CAGATTAACC ACCATTGGTA CAAGGCTGGA AGCACGCTGG GCAAAGCCTT TTCAACGACT TTGAAGGGAG CTCAAAGACT GGCAGCGTTG GGCGACACAG CCTGGGACTT TGGCTCTATT GGAGGGGTCT TCAACTCCAT AGGGAAAGCT GTTCACCAAG TGTTTGGTGG TGCCTTCAGA ACACTCTTTG GGGGAATGTC TTGGATCACA CAAGGGCTAA TGGGGGCCCT ACTACTTTGG ATGGGCATCA ACGCACGAGA CCGATCAATT GCTTTGGCCT TCTTAGCCAC AGGAGGTGTG CTCGTGTTCT TAGCTACCAA TGTGCATGCT //

ID BV-WSV-0310_N PRELIMINARY; ADN; 1500 BP. SQ SEQUENCE 1500 BP; 393 A; 362 C; 411 G; 334 T;

Sản phẩm PCR được thu nhận bằng phương pháp thôi gel, tinh chế bằng QIAquick PCR Purification Kit sau đó giải trình tự bằng máy giải trình tự gen ABI 3500. Sau khi giải trình tự, các chương trình phần mềm chuyên dụng như Blast, BioEdit, MEGA6.0... đã được sử dụng để phân tích, đánh giá mức độ tương đồng và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự vùng gen E của chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310. Kết quả cho thấy, gen mã hóa kháng nguyên E có độ dài 1500 bp, tỷ lệ G/C là 52%, mã hóa cho một protein có độ dài 500 axit amin. Thơng tin về trình tự nucleotide và protein gen E được nêu trong hình 3.5. và 3.6.

Độ dài và trình tự các nucleotide và protein của gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc, chủng sản xuất và chủng tham chiếu là hoàn toàn giống nhau. Các chủng này có sự tương đồng 100% cả về nucleotide và axit amin. Tuy nhiên, khi so sánh trình tự nucleotode và axit amin của chủng gốc và chủng sản xuất với trình tự gen mã hóa kháng ngun E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt Nam thì tỷ lệ phần trăm tương đồng rất khác nhau (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Tỷ lệ tương đồng về nucleotide và protein gen mã hóa kháng nguyên E

của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) so với trình tự vùng gen E của các chủng virút VNNB phân lập ở Việt Nam trong các năm khác

nhau và từ các vật chủ khác nhau STT Số đăng ký trong GenBank Năm phân lập Vật chủ Genotype Tỷ lệ tương đồng (%) của MSV, WSV so với các chủng VNNB phân lập ở VN từ 1964-2014 Nucleotide Protein 1 LC000631 1964 Người GIII 97,45 98,31 2 AY376461 1986 Người 96,40 99,00 3 AY376463 1989 Người 96,73 99,20 4 HQ009263 2004 Người 97,53 97,20 5 LC000634 2007 Người GI 87,45 96,73 6 KP876007 2014 Người 86,67 97,04 7 AY376464 2001 Lợn GI 88,33 98,40 8 AY376465 2002 Lợn 88,27 98,40 9 HQ009265 2005 Lợn 87,47 98,00

10 JEU70420 1979 Muỗi GIII 99,00 98,06

11 AB933311 1994 Muỗi GI 88,05 98,22

12 AY376468 2002 Muỗi 88,33 98,40

13 JN574431 2005 Muỗi 87,80 98,04

14 LC000635 2010 Muỗi 87,54 96,77

So sánh trình tự nucleotide và trình tự protein gen E của chủng sản xuất, chủng gốc với các chủng virút VNNB phân lập ở Việt Nam, đặc biệt các chủng phân lập từ người, kết quả cho thấy, tỷ lệ này dao động từ 86,67 đến 97,53% đối với nucleotide và 97,2 đến 99,20% đối với protein. Trên người hay muỗi hay lợn, các chủng thuộc genotype III (GIII) sự tương đồng nucleotide và protein đều >95% và cao hơn hẳn các chủng thuộc genotype I (GI) (sự tương đồng nucleotide chỉ 86-88,3% nhưng sự tương đồng protein đều >94%). Vậy liệu các epitope có tính quyết định đối với đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể trung hịa virút có thay đổi hay khơng?

c. Kết quả xác định các vị trí epitope của protein E của chủng sản xuất

Chúng tôi đã dịch mã các chủng trong nghiên cứu và kiểm tra các vị trí epitope (yếu tố quyết định kháng nguyên, đoạn protein kết hợp trực tiếp với kháng thể) và các axit amin quyết định tính kháng nguyên thuộc epitope theo kết quả nghiên cứu của Luca và cộng sự. Kết quả được nêu trong bảng 3.7.

Bảng 3.7. Vị trí các epitope và vị trí của các axit amin quyết định tính kháng

nguyên thuộc epitope protein E của chủng sản xuất (BV-WSV-0310), chủng tham chiếu (Beijing-1 Kanonji), chủng vi rút VNNB phân lập ở người năm 2014 và

chủng vắc xin SA14-14-2. Domain II-vòng

nối protein E Khớp nối Domain I-II

Khe bên

Domain I Khe bên của Domain III Vị trí epitope trung hịa 104 106 107 52 126 136 275 179 337 360 302 387 AA của chủng SA14-14-2 (Luca et al.) G G L Q I K S K I F G R AA của BV- WSV-3010 G G L Q I K S K I F G R AA của 2014_KP876007 _Human_ProE G G L Q I K S K I F G R AA của chủng Kanonji G G L Q I K S K I F G R

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, các epitope thuộc gen mã hóa kháng nguyên E ở chủng sản xuất, chủng tham chiếu, chủng vắc xin SA14-14-2 và chủng virút VNNB phân lập từ người ở Việt Nam năm 2014 đều khơng thay đổi.

Bảng 3.8. Tính ổn định hiệu giá chủng gốcBV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-

WSV-0310 khi bảo quản trong nitrogen lỏng

Thời gian nghiên cứu

Hiệu giá virus trên tế bào (log PFU/ml)

Lô chủng BV-MSV-0210

Lô chủng sản xuất BV-WSV-0310

Năm 2010(thời điểm 0) 7,94 7,59

Sau 3 năm / 7,57

Sau 4 năm / 7,57

Sau 6 năm 7,87 7,58

Sau 8 năm 7,92 7,54

Sau 9 năm / 7,56

Sau 10 năm (năm 2020) 7,89 7,53

Ghi chú: “/” là không làm.

Ngồi ra chủng cịn được giám sát trong suốt quá trình bảo quản, sử dụng, cất giữ từ 2010 đến nay (2020) qua bảng 3.8.

Kết quả nghiên cứu tại bảng 3.8 cho thấy, sau sản xuất và bảo quản trong nitrogen lỏng, hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310 gần như khơng có sự thay đổi sau sản xuất đến năm 2020,10 năm sau bảo quản trong nitrogen lỏng.Chủng gốc BV-MSV-0210 hiệu giá luôn cao hơn chủng sản xuất BV- WSV-0310 từ 0,3-0,4 log và giao động giữa các lần thử nghiệm của cả 2 lô chủng chỉ giảm tối đa chỉ từ 0,06 - 0,07 log(bảng 3.8).

Bảng 3.9. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở -20oC

Thời gian nghiên cứu năm 2017 Hiệu giá vi rút trên tế bào (log PFU/ml)

Thời điểm sau sản xuất 7,94

1 tháng 7,33

3 tháng 6,03

6 tháng 5,28

Kết quả nghiên cứu tại bảng 3.9 cho thấy, hiệu giá vi rút khi bảo quản chủng ở -20oC. Sau 1 tháng giảm 0,61 log; sau 3 tháng giảm 1,91 log (về sát giới hạn tiêu chuẩn cho phép của chủng WSV dự kiến là ≥ 6,0 log), và sau 6 tháng thì giảm sâu rõ rệt (2,66 log) và thấp hơn tiêu chuẩn cho phép (bảng 3.9).

Bảng 3.10. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở 2-8oC

Thời gian nghiên cứu năm 2017 Hiệu giá virút trên tế bào (log PFU/ml)

Thời điểm sau sản xuất 7,94

1ngày 6,77

3 ngày 6,48

5 ngày 5,55

7 ngày 5,42

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu giá chủng BV-WSV-0310bảo quản ở 2-8oC sau 1 ngày giảm 1,17 log; sau 3 ngày giảm 1,46 log vẫn đạt so với tiêu chuẩn (≥ 6,0 log). Nhưng sau 5-7 ngày thì giảm sâu rõ rệt, 2,39-2,52 log và thấp hơn tiêu chuẩn cho phép (bảng 3.10).

3.1.1.4. Kết quả đánh giá một số chỉ số chất lượng khác của chủng gốc BV-MSV- 0210và chủng sản xuất BV-WSV-0310

Kết quả nghiên cứu tại bảng 3.11 cho thấy, chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) được kiểm tra vô trùng bằng phương pháp cấy trực tiếp vào môi trường FTM và môi trường Thiolycolate. Sau 14 ngày nuôi cấy huyền dịch chủng, 100% các ống môi trường FTM và Thioglycolate được cấy chủng gốc và chủng sản xuất khơng có sự phát triển của vi nấm và vi khuẩn (bảng 3.11).

Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm vô trùng

Môi trường Tiêu chuẩn

Tỷ lệ đạt yêu cầu

BV-MSV-0210 BV-WSV-0310

N % N %

Môi trường FTM Không phát hiện vi nấm sau 14

ngày 10 100 10 100

Môi trường Thioglicolate

Không phát hiện vi khuẩn sau

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra Mycoplasma chủng gốc và chủng sản xuất

Môi trường Tiêu chuẩn

Tỷ lệ đạt yêu cầu

BV-MSV-0210 BV-WSV-0310

N % N %

Môi trường lỏng I

Không phát hiện Mycoplasma sau 21

ngày 2 100 2 100

Môi trường lỏng II

Không phát hiện Mycoplasma sau 21

ngày 2 100 2 100

Môi trường thạch đặc

Không phát hiện Mycoplasma sau 21

ngày 2 100 2 100

Chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) được kiểm tra Mycoplasmaphương pháp cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc. Sau 21 ngày nuôi cấy huyền dịch chủng, 100% các ống môi trưởng lỏng I, môi trường lỏng II và môi trường thạch không phát hiện sự phát triển của Mycoplasma (bảng 3.12).

Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1

Một số vắcxin VNNBsản xuất từ chủng Beijing-1

Dịng tế bào ni cấy (nhân) virút